[发明专利]一种基于全自动数字PCR一体机的单细胞检测方法

说明书

本发明涉及单细胞检测分析领域，公开了一种用于单细胞检测和分析的方法。该方法通过利用全自动数字PCR一体机实现对样品进行单细胞分离、细胞裂解和检测分析，实现了数字PCR一体机应用范围的扩大，使其能够用于微量细胞的检测，同时能够精准检测样品中每个单细胞内的目标基因。本发明的方法具有可视化操作，检测结果准确快速，同时进行定性和定量检测的优点。

技术领域

本发明涉及一种单细胞检测的方法，具体涉及一种使用数字PCR仪器对单细胞进行检测的方法，特别涉及一种使用全自动数字PCR一体机进行单细胞检测的方法。

背景技术

随着现代生物学的发展和社会需求的不断提高，仅分析细胞群体的核酸序列已经不能满足需要，有必要对单细胞进行检测和测序。

为满足以上需求，发展出了qPCR技术，其基本原理是，通过荧光活化细胞分选、免疫磁性富集、显微抽取、流式细胞术、激光捕获显微切割或各种自动化的设备，例如哈佛大学的液滴测序技术(Drop-seq)来收集单个细胞，进行裂解并收集和提纯核酸物质，扩增和测序。

然而，以上的操作仍然是非常繁琐的，分离出的细胞需要转移到对应的微反应体系中进行裂解和核酸物质的提取与纯化，之后再转移到对应的微反应体系，或者加入扩增原料进行扩增。在需要对大量细胞进行以上操作时，即使完全自动化完成，效率也是较为低下的。在不同的步骤中使用的酶和原料也可能相互干扰，导致难以进行一站式操作。

数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，其采用微流控或微液滴化方法，将稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微液滴中，每个反应器的核酸模板数少于一个或等于一个，经过PCR循环后，有核酸分子模板的反应器会给出荧光信号，没有模板的反应器没有荧光信号，从而可以推测出原始溶液的核酸浓度。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种单细胞检测的方法，其特征在于：

步骤一：制备单细胞分离体系；

所述单细胞分离体系包括经荧光染色的待测细胞、扩增原料、引物、探针和Taq酶；

步骤二：使用全自动数字PCR一体机，将所述单细胞分离体系分散成至多包含一个细胞的微液滴，并使微液滴平铺在数字PCR检测板上；

步骤三：在明场和荧光场观察，对包裹有细胞的微液滴计数；

步骤四：热裂解细胞，在荧光下观察微液滴，对仍能够观察到存在细胞形态的微液滴进行即时计数，并计算细胞裂解率，直至细胞裂解率达到预设值，细胞裂解率=(步骤三中包括有细胞的微液滴数-仍具细胞形态的微液滴数)/步骤三中包括有细胞的微液滴数；

步骤五：升温至95℃继续加热10-20分钟，优选15分钟，以启动Taq酶，并降温退火，完成第一次扩增；循环进行预定次数的扩增，统计高亮微液滴数。

所述全自动数字PCR一体机，指将在一台设备上实现全自动微液滴生成、PCR扩增、荧光信号收集的数字PCR仪器。示例性的型号如：Sniper公司的DQ-24，赛默飞公司的Applied Biosystems™QuantStudio™ Absolute Q™等，不同厂商的型号在处理能力上有所区别，但均不影响实施本发明的技术方案。

作为优选，步骤二中，使用全自动数字PCR一体机的控制程序，设定所述微液滴体积为0.3至1.5nL之间的数值，更优选地，设定0.6至1.0 nL的数值。

作为优选，步骤二中观察发现微液滴有重叠时，加热到60℃，使微液滴平铺。实验中发现，通过加热可以在5分钟内使微液滴有效平铺，因此加热时间可以统一设定为5分钟，也可以在观察到重叠消失后停止加热。

在步骤三、步骤四和步骤五中，可以人工计数，也可以自动计数和计算。