[发明专利]B型副鸡禽杆菌抗原PilA蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种B型副鸡禽杆菌抗原PilA蛋白，其特征在于：其具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

2.权利要求1所述B型副鸡禽杆菌抗原PilA蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种用于表达B型副鸡禽杆菌抗原PilA蛋白的重组载体，其特征在于：所述重组载体包含如权利要求1所述的B型副鸡禽杆菌抗原PilA蛋白的编码基因。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体的原核表达载体包括pET32a载体、pET28a载体、pGEX-6P-1载体或pCold载体。

5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述B型副鸡禽杆菌抗原PilA蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

6.一种用于表达B型副鸡禽杆菌抗原PilA蛋白的重组载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1）引物设计及合成：

按照pilA基因序列设计上下游引物，上下游引物分别引入BamHI、HindIII酶切位点，上、下游引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其中，上游引物PilA-F的引物序列（5’-3’）为CGCGGATCCCAAAACCCAACCCATT，下游引物PilA-R的引物序列（5’-3’）为CCCAAGCTTTCCGCAAAATCCCGCT；上游引物PilA-F引物序列的序列表为SEQ ID NO.3，下游引物PilA-R引物序列的序列表为SEQ ID NO.4；

步骤2）目标基因PCR扩增：

以B型副鸡禽杆菌Spross菌株模板作为扩增目标基因序列的模板，利用合成的上、下游引物进行PCR扩增，得目标基因扩增产物，该目标基因扩增产物的两端分别含有酶切位点；其中，B型副鸡禽杆菌Spross菌株模板的制备过程为：将B型副鸡禽杆菌Spross菌株利用利用TSA平板进行复苏，然后用PBS缓冲液洗下平板上的菌苔，煮沸，作为B型副鸡禽杆菌Spross菌株模板；

3）目标基因序列验证

对目标基因扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析以及基因测序分析，验证PCR扩增获得的目标基因扩增产物与菌株C型副鸡禽杆菌FARPER-174菌株pilA基因序列的一致性；

步骤4）目标基因酶切及回收：

目标基因扩增产物利用凝胶电泳进行分离，而后进行胶回收，得pilA目标基因；而后将得到的pilA目标基因进行BamHI和HindIII双酶切，得酶切产物；而后将酶切产物利用凝胶电泳进行分离，而后进行胶回收，得pilA目标基因片段；

步骤5）表达载体的酶切及回收：

对原核表达载体进行BamHI和HindIII双酶切，并回收酶切产物，得到表达载体片段，其中，原核表达载体的酶切及回收方法与步骤3）酶切及回收方法相同；

步骤6）目标基因片段和载体的连接：

将步骤4）回收纯化的目标基因片段和步骤5）回收纯化的表达载体片段进行连接，得连接产物，而后对连接产物进行转化获得转化后的菌落，而后对转化后的菌落鉴定，PCR扩增并经凝胶电泳鉴定正确的阳性克隆菌株，提取质粒，然后，按照步骤4）目标基因酶切及回收方法对提取的质粒进行BamHI和HindIII双酶切，得质粒双酶切产物，而后利用凝胶电泳对质粒双酶切产物进行鉴定。

7.一种宿主细胞，其特征在于：由权利要求3、4、5和6中的任一种所述的重组载体转化受体细胞而得。