[发明专利]一株无色素产生的骆驼刺泛菌及其在制备胞外多糖中的应用

权利要求书

1.一株无色素产生的骆驼刺泛菌，其特征在于，所述骆驼刺泛菌以骆驼刺泛菌Pantoea alhagi XK-11作为出发菌株，通过敲除XK-11基因组中的八氢番茄红素合成酶基因crtB构建获得，命名为Pantoea alhagi XK-11ΔcrtB，其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的骆驼刺泛菌，其特征在于，所述crtB基因利用Crispr/Cas9工具实现敲除的。

3.权利要求1所述的骆驼刺泛菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以骆驼刺泛菌Pantoea alhagi XK-11基因组为模版，PCR扩增crtB上下游同源片段，分别为crtB-UP，crtB-DN；以pTarget质粒为模版，克隆带有crtB sgRNA序列的片段crtB-sgRNA，胶回收后，通过重叠PCR获得基因片段crtB-sgRNA-UP-DN；对质粒pTarget进行反向PCR，获得pTarget骨架片段，将获得的pTarget骨架片段和重叠片段crtB-sgRNA-UP-DN通过重组酶 Exnase Ⅱ在37℃下进行In-fusion克隆，并转入E. coli DH5α，涂布至含有链霉素抗性的LB固体培养基中过夜培养，挑取阳性克隆，获得重组质粒pTarget-crtB；

（2）将pCas质粒通过电转化转化至骆驼刺泛菌XK-11感受态细胞中，获得带驼刺泛菌XK-11（pCas）感受态细胞；

（3）将重组质粒pTarget-crtB通过电转化转化至骆驼刺泛菌XK-11（pCas）感受态细胞中，涂布至含有Km^r和Str^r双抗的LB固体培养基中，30℃，培养24 h；

（4）挑取阳性克隆接种至含Km^r和IPTG的LB培养基中，30℃，200 rpm过夜培养并连续传代，直至菌株无法在Str^r抗性平板中生长，得到pTarget-crtB重组质粒丢失的菌株，随后，将丢失pTarget-crtB重组质粒的菌株接种至LB培养基中，37℃，200 rpm过夜培养，并连续传代，直至菌株无法在Km^r抗性平板中生长，得到的突变菌株命名为骆驼刺泛菌XK-11ΔcrtB。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2），电转化条件为：电场强度25 kV/cm，电击时间4 msec。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，电转化条件为：电场强度25kV/cm，电击时间4 msec。

6.权利要求1所述的骆驼刺泛菌在发酵制备骆驼刺泛菌胞外多糖上的应用功能。