[发明专利]一株无色素产生的骆驼刺泛菌及其在制备胞外多糖中的应用

说明书

本发明公开了一株无色素产生的骆驼刺泛菌突变菌，其以骆驼刺泛菌Pantoea alhagi XK‑11作为出发菌株，通过敲除XK‑11基因组中的八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase）基因crtB构建获得。本发明同时公开了该工程菌的应用，用于发酵制备骆驼刺泛菌胞外多糖。与出发菌株XK‑11相比，本发明公开的工程菌XK‑11ΔcrtB制备胞外多糖的提纯过程乙醇用量较少，干燥后多糖颜色为纯白色，显著降低了生产成本，胞外多糖品质提升，可用于日化保湿、食品增稠、医用凝胶等产品的开发。

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一株无色素产生的骆驼刺泛菌及其在制备胞外多糖中的应用。

背景技术

微生物胞外多糖是由微生物分泌的一种生物大分子。由于其单糖组成、糖苷键的多样性，胞外多糖展现出了诸如增稠性、乳化行、抗氧化性、抗肿瘤等多种多样的功能，使其在医药、食品、农业、工业等众多领域均体现出了较好的应用潜力。

泛菌多糖是近年来新发现、鉴定的一种由骆驼刺泛菌分泌的酸性杂多糖。泛菌多糖由葡萄糖、半乳糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成。目前，泛菌多糖已被证明在农业领域有较强的促进植物生长与增强植物抗逆的能力。然而，骆驼刺泛菌在发酵过程中还分泌大量的色素，色素与产物多糖极易通过静电螯合、离子键等作用形成复合体，这极大的提高了下游分离的难度。目前主流的方式是通过活性炭脱色或乙醇脱洗的方案去除色素。其中活性炭脱色在工业生产中容易产生活性炭固废，增加了生产企业的环评、安评成本；乙醇脱色需要使用大量的乙醇以及乙醇回收，也极大的增加了产品的终端成本。因此，受限于这一因素，使得骆驼刺泛菌胞外多糖在食品、日化、医疗等对产品品质要求较高的领域的应用推广受到了较大的阻碍。因此，如果能够通过基因工程手段，构建无色素产生的泛菌多糖合成菌株，降低下游分离成本，对于其多领域的工业化应用至关重要。

发明内容

发明目的：为解决骆驼刺泛菌胞外多糖脱色纯化难的问题，本发明提供了一种无色素产生的泛菌多糖合成菌株及其构建方法和其在高产无色泛菌多糖中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一株无色素产生的骆驼刺泛菌，所述骆驼刺泛菌以骆驼刺泛菌Pantoea alhagi XK-11作为出发菌株，通过敲除XK-11基因组中的八氢番茄红素合成酶基因crtB构建获得，命名为Pantoea alhagi XK-11ΔcrtB，其中，所述八氢番茄红素合成酶基因crtB的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述工程菌XK-11ΔcrtB在表型上不再具有出发菌XK-11的黄色色素。

所述crtB基因利用Crispr/Cas9工具实现敲除的。

本发明进一步提出了上述骆驼刺泛菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以骆驼刺泛菌Pantoea alhagi XK-11基因组为模版，PCR扩增crtB上下游同源片段，分别为crtB-UP，crtB-DN；以pTarget质粒为模版，克隆带有crtB sgRNA序列的片段crtB-sgRNA，胶回收后，通过重叠PCR获得基因片段crtB-sgRNA-UP-DN；对质粒pTarget进行反向PCR，获得pTarget骨架片段，将获得的pTarget骨架片段和重叠片段crtB-sgRNA-UP-DN通过重组酶ExnaseⅡ在37℃下进行In-fusion克隆，并转入E.coli DH5α，涂布至含有链霉素抗性的LB固体培养基中过夜培养，挑取阳性克隆，获得重组质粒pTarget-crtB；

(2)将pCas质粒通过电转化转化至骆驼刺泛菌XK-11感受态细胞中，获得带驼刺泛菌XK-11(pCas)感受态细胞；

(3)将重组质粒pTarget-crtB通过电转化转化至骆驼刺泛菌XK-11(pCas)感受态细胞中，涂布至含有Km^r和Str^r双抗的LB固体培养基中，30℃，培养24h；