[发明专利]一种耐胆盐发酵乳杆菌快速检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种耐胆盐发酵乳杆菌快速检测方法及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过对发酵乳杆菌耐胆盐优势株和劣势株的比较基因组筛选到了可能的耐胆盐功能基因，对其进行验证后得到了耐胆盐功能基因sfcA，能将发酵乳杆菌耐胆盐的优势株和劣势株区分开，此筛选方法快于传统的耐胆盐能力评价。基于此基因片段，设计引物扩增得到的目的条带为1164bp。本发明的耐胆盐基因可用于耐胆盐发酵乳杆菌的快速筛选。

技术领域

本发明涉及一种耐胆盐发酵乳杆菌快速检测方法及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

胆汁酸是以胆固醇为前体在肝细胞中合成，储存在胆囊中，当摄入食物后排泄到小肠近端溶解脂溶性营养物质。当它们通过小肠时，大部分胆汁酸(＞95％)在回肠末端被重新吸收，经历肠肝循环。胆盐是由肝细胞分泌的胆汁酸通过酰胺键与甘氨酸或牛磺酸结合形成的钠盐或钾盐。胆盐是一种具有乳化剂性质的弱酸，高浓度胆盐会破坏细胞膜的正常结构，甚至造成细胞死亡。同时，胆盐胁迫会导致蛋白质折叠或变性。因此，耐胆盐能力是益生菌的一个重要评价标准。

发酵乳杆菌是一类发酵后产生乳酸和大量乙酸、乙醇和CO₂的异源发酵菌种，该种菌能发酵半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖等多种糖，产酸，而且具有很强的耐酸能力，但是发酵乳杆菌的耐胆盐能力存在明显的株间差异。基于传统的模拟肠液的方法可以评价乳杆菌在pH8，0.3％胆盐存在条件下的存活率，采用梯度稀释平板计数法测定胆盐处理4h前后的活菌数，通常需要48～60h得到耐胆盐存活率结果(专利公开号CN112111433A)。在此基础上，也有通过将菌株接种于含有/不含胆盐的培养基中来模拟胃肠道的碳源、氮源，计算菌株在胆盐胁迫下的生长率，该种方法也需要测定耐受前后细菌的活菌数(专利公开号CN103571776A)。因此，开发快速检测发酵乳杆菌耐胆盐能力的方法用于评估其作为益生菌的潜能显得尤为重要。

近年来，随着分子生物学的发展，可以通过16SrDNA测序的方法对细菌进行种属鉴定，但基于16SrDNA测序不能精确区分同一菌种的不同菌株，并且缺少分子标记对耐胆盐菌株进行筛选。已有的研究报道将发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)MTCC8711的bsh1和bsh2克隆到乳酸菌表达质粒pSLp111.3上，诱导表达后发现仅bsh2含有胆盐水解酶活性(DOI：10.1007/s12010-014-1118-5)。然而，在1.2％胆盐处理后的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)NCDC400蛋白组差异数据中并没有发现胆盐水解酶，这可能是由于这种蛋白质在胆盐胁迫下表达水平非常低(DOI：10.1016/j.jprot.2017.08.008)。这些研究表明，胆盐水解酶基因与胆盐抗性之间无法进行直接关联，发酵乳杆菌的耐胆盐功能基因仍待挖掘。因此，急需挖掘可能的胆盐耐受基因作为分子标记，用于通过PCR达到快速筛选耐胆盐发酵乳杆菌的目的。

发明内容

本发明的目的是针对目前耐胆盐菌株筛选周期长，结果平行性差的背景下，通过10株发酵乳杆菌(5株耐胆盐优势株和5株耐胆盐劣势株)的比较基因组学分析筛选得到耐胆盐的功能基因，结合qPCR技术验证后，选取与发酵乳杆菌耐胆盐相关的sfcA基因作为筛选标记，以该基因序列为基础设计引物，通过PCR技术进行耐胆盐发酵乳杆菌的快速筛选。该方法可用于快速检测对胆盐耐受的发酵乳杆菌菌株。

本发明的第一个目的是提供一种鉴定耐胆盐的发酵乳杆菌的标记基因，所述标记基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定耐胆盐的发酵乳杆菌的引物组，所述引物组包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定耐胆盐的发酵乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述引物组。

在一种实施方式中，所述试剂盒中还含有PCR反应试剂、qPCR反应试剂或ddPCR反应试剂。