[发明专利]一种制备间充质干细胞的方法、间充质干细胞和应用

权利要求书

1.一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括：

步骤1）提供扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物；

步骤2）将所述扩展多潜能干细胞或包括扩展多潜能干细胞的细胞培养物置于滋养层干细胞分化培养基中培养，得到滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物；所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、2-巯基乙醇、KnockOut™血清替代物、ITS-X补充剂、L-AA-pi、表皮细胞生长因子、GSK3β受体抑制剂CHIR99021、ALK4/5/7抑制剂A83-01、ALK5抑制剂SB431542、丙戊酸、ROCK抑制剂Y27632和BMP4；所述基础培养基是E6培养基或者是由DMEM/F-12培养基和IMDM培养基按照1:1配置；

步骤3）将所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物置于间充质干细胞分化培养基中培养，得到间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物；所述间充质干细胞分化培养基包括α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、2-巯基乙醇、胎牛血清和人血小板提取物；

步骤4）将所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物置于所述间充质干细胞扩增培养基中进行传代培养，同时保持间充质干细胞的特性；所述间充质干细胞扩增培养基由α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、0.1 mM 2-巯基乙醇、5%胎牛血清和5% 人血小板提取物组成；

所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是表达CD44、CD73、CD90、CD105、CD166细胞表面标志物的间充质干细胞；

在16代或更多代的间充质干细胞中，表达所述CD44、CD73、CD90、CD105、CD166的细胞比例不低于95%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）进行4-8天。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤2）进行6天。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5-7天得到P1代细胞，所述P1代细胞继续分化培养6-9天得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物；

所述步骤4）包括：所述P1代细胞传代培养得到P2代细胞，所述P2代细胞传代培养至P3代细胞，所述P3代细胞传代培养至P4代细胞，所述P4代细胞继续进行后续传代培养，每3天传代一次。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3）包括：所述滋养层干细胞或包括滋养层干细胞的细胞培养物分化培养5天得到P1代细胞，所述P1代细胞继续分化培养7天得到所述间充质干细胞或包括间充质干细胞的细胞培养物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滋养层干细胞分化培养基包括基础培养基、0.1 mM 2-巯基乙醇、20% KnockOut™血清替代物、1% ITS-X补充剂、1.5 μg/ml L-AA-pi、50 ng/ml 表皮细胞生长因子、2 μM CHIR99021、0.5 μM A83-01、1 μM SB431542、0.8mM 丙戊酸、5 μM Y27632和10 ng/mL BMP4。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞分化培养基由α-MEM培养基、1×NEAA细胞培养添加物、1×GlutaMax添加剂、0.1 mM 2-巯基乙醇、5%胎牛血清和5%人血小板提取物组成。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中获得的滋养层干细胞是表达GATA3、KRT7细胞表面标志物的滋养层干细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3）和步骤4）中获得的间充质干细胞是能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞和心肌细胞的多能性间充质干细胞。