[发明专利]一种氰水合酶菌株构建方法及应用于烟酰胺生产

说明书

本发明提供了一种基因工程菌。本发明提供的基因工程菌，能够在宽泛的温度范围内高效表达可溶性腈水合酶，获得的酶活性高。利用该基因工程菌生产腈水合酶，发酵过程中无需低温诱导，减少能耗，并且获得的腈水合酶可以高效催化烟腈制备烟酰胺。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种氰水合酶菌株构建方法及应用于烟酰胺生产。

背景技术

腈水合酶(Nitrile Hydratase，EC4.2.1.84，简称NHase)是一种能够催化腈类物质水解生成酰胺类化合物的金属酶，主要用于工业上的丙烯酰胺和烟酰胺的生产。目前大部分的腈水合酶来自微生物发酵。

大肠杆菌是腈水合酶的重要生产工具。大肠杆菌具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产重组酶等优点。并且大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

然而，大肠杆菌在制备腈水合酶过程中，容易形成没有生物活性的包涵体，这主要是因为在重组蛋白的大量表达过程中，缺乏某些蛋白质正确折叠所需要的酶和分子伴侣等，或因环境不适无法形成正确的次级键等。

因此，需要开发一种新的生产腈水合酶的菌株。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基因工程菌及其构建方法和应用，解决随着培养温度升高，包涵体增加的问题。

为达此目的，第一方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌中导入了腈水合酶的基因和L-精氨酸生物合成途径的酶的基因；并且所述基因工程菌中敲除了分解L-精氨酸的酶的基因。

依据腈水合酶活性中心所含金属离子不同，腈水合酶分为钴型腈水合酶和铁型腈水合酶。对于钴型腈水合酶，根据其分子量大小，分为高分子量腈水合酶和低分子量腈水合酶。在一些实施方式中，所述腈水合酶优选为钴型的高分子量腈水合酶。

在一些实施方式中，所述腈水合酶来自于玫瑰色红球菌Rhodococcusrhodochrous，且按照大肠杆菌的密码子进行序列优化。

在一些实施方式中，所述腈水合酶基因如SEQ ID NO.13所示。

在一些实施方式中，腈水合酶基因可以重组在载体上，也可以整合到基因工程菌的染色体上。

在一些实施方式中，所述基因工程菌包含腈水合酶基因的载体。该载体选自pET42a载体、pET32a载体、pET-30a载体和pET28a载体。

在一些实施方式中，L-精氨酸生物合成途径的酶的基因可以重组在载体上，也可以整合到基因工程菌的染色体上。在一些实施方式中，所述基因工程菌包含L-精氨酸生物合成途径的酶的基因的载体。该载体可以为pBV220载体。

在一些实施方式中，所述L-精氨酸生物合成途径的酶选自argA(N-乙酰谷氨酸合酶)、argB(N-乙酰谷氨酸激酶)、argC(N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶)、argD(乙酰鸟氨酸脱乙酰酶)、argF(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、argG(精氨琥珀酸合成酶)、argH(精氨酰琥珀酸裂解酶)和argJ(鸟氨酸乙酰转移酶)中的至少一种。

在一些实施方式中，所述L-精氨酸生物合成途径的酶选自argA(N-乙酰谷氨酸合酶)、argB(N-乙酰谷氨酸激酶)、argC(N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶)、argD(乙酰鸟氨酸脱乙酰酶)、argF(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、argG(精氨琥珀酸合成酶)、argH(精氨酰琥珀酸裂解酶)和argJ(鸟氨酸乙酰转移酶)中至少两种，例如3种、4种、5种、6种、7种或8种。

在一些实施方式中，所述L-精氨酸生物合成途径酶选自argB(N-乙酰谷氨酸激酶)和/或argJ(鸟氨酸乙酰转移酶)。