[发明专利]微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用，其内部包扩四种优势线性表位多肽，其序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。将以上含有Tau蛋白线性表位多肽的序列通过柔性链氨基酸串联得到所述微管相关蛋白Tau抗原的氨基酸序列，如SEQ ID NO.5所示。本发明所述的重组Tau蛋白抗原是通过原核细胞Ecoli表达并纯化，表达的蛋白抗原纯度高。本发明提供的可溶性Tau蛋白抗原具有良好的免疫原性，用重组Tau蛋白抗原免疫动物能够产生特异性的多抗，并且可以识别的六种不同Tau蛋白亚型。故该抗原可作为一种高效的免疫原用于免疫和抗体制备和生产，从而用于对Tau蛋白的科研检测和认知功能障碍这类疾病标志物Tau的诊断。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用。

背景技术

Tau蛋白和β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)是阿兹海默症(Alzheimer'sdisease，AD)的特征性病变，是决定神经退行性病变发生和发展的两种重要因素。Tau蛋白由位于17q21.31染色体的微管相关蛋白Tau(microtubule-associated protein Tau，MAPT)单基因编码产生。Tau蛋白有多种功能。正常情况下，其最重要的功能是聚合微管，包括连接、稳定和促进微管组装，其他还包括在轴突、树突中运输营养物质及调控神经细胞的生长发育等。大量微管位于神经轴突，少部分位于树突和神经元。

异常的翻译后修饰致使Tau蛋白成为无功能的实体，其中研究最多的是Tau蛋白的磷酸化。目前公认，Tau蛋白增多和修饰形成的Tau病变是神经毒性的来源。通常情况下，Tau病变有3个主要特点：Tau蛋白水平增高；涉及一种异常翻译后修饰，如过度磷酸化，有时和其他翻译后修饰(如截断或乙酰化)相关；异常Tau蛋白聚集。而一旦Tau蛋白出现沉积，则伴随神经功能失调的发生。Tau蛋白的水平和轻度认知功能障碍密切相关。

AD患者中的特征性脑脊液生物标记物变化为Aβ42下降，同时总Tau蛋白(totalTau，T-Tau)和磷酸化Tau蛋白(phosphorylated Tau，p-Tau)上升，这些标记物已经被确认可用于诊断痴呆、轻度认知功能损害。

在人类中，编码Tau蛋白的基因MAPT通过选择性mRNA剪接产生六种亚型(352-441个氨基酸)。根据人tau蛋白外显子2、3和10的剪切，分成6种不同的亚型，分别为tau352(0N3R)、tau381(1N3R)、tau383(0N4R)、tau410(2N3R)、tau412(1N4R)和tau441(2N4R)，其中外显子2和3编码两段29个氨基酸的N端插入序列(0N，1N，2N)外显子10会导致产生具有3个或4个C末端重复的三个同种型(3R或者4R)，通过不同的剪切模式，形成6种不同的剪切后亚型。以Tau(2N4R)最长亚型蛋白为例展示其结构区域，主要包括N末端投射功能区(aa1-151)，2N插入序列位于此段，中间脯氨酸富集区(aa152-244)、微管结合区(Microtubule-binding domain，MBD，aa245-368)，包含四个C末端重复序列4R和C末端功能区(C端，aa369-441)。

根据Meredith、Barthe′lemy、Sato、Cicognola、Chen在2013-1019年间的研究报道发现在人脑脊液或血浆中Tau蛋白因受蛋白酶切割作用，大量以N末端(aa1-151)和中间区域Tau剪切片段(aa152-244)存在，而C末端片段含量极低。因此如何设计并合成的免疫原，从而可以囊括同时识别血浆及脑脊液中不同Tau蛋白亚型的切割体形式抗体的表位，成为检测人组织或体液中总tau蛋白(t-Tau)的关键环节。脑脊液T-tau水平测定对区分AD和正常对照(T-tau：95％ CI为2.44～2.64，P＜0.0001)以及稳定型和进展型轻度认知障碍(mild cognitive impairment，MCI)都具有诊断性价值以及AD预测价值。