[发明专利]重组犬PD-1和犬SIRPα双融合蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及犬类肿瘤治疗领域，公开了重组犬PD‑1和犬SIRPα双融合蛋白的制备方法及其应用，其中，所述融合蛋白包含犬PD‑1蛋白胞外区突变体和犬SIRPα蛋白。本发明所述的融合蛋白无血液毒性，安全性好，且能够同时与肿瘤细胞上的PD‑L1和CD47结合，抑制肿瘤细胞与T细胞和巨噬细胞的结合，从而促进T细胞激活和巨噬细胞的吞噬活性，达到杀伤肿瘤细胞的目的。

技术领域

本发明涉及犬类肿瘤治疗领域，具体涉及一种融合蛋白、编码如上所述的融合蛋白的核酸，一种含有所述融合蛋白的编码基因的生物材料，一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，一种药物组合物，一种试剂盒，所述融合蛋白、核酸或生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的药物中的应用。

背景技术

肿瘤是人类和动物的一种常见病、多发病，其中犬恶性肿瘤已经成为导致犬死亡的主要原因。国外研究报告数据显示：每4只犬中就有一只被诊断为肿瘤；10岁以上犬患肿瘤的比例更是高达50％以上。目前犬肿瘤的临床治疗手段主要包括手术、化学治疗和放射性治疗。常见的化疗药物包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙等，这些均存在肿瘤特异性差和毒副作用大等缺点。目前国外已有一些小分子药物和蛋白药物被批准用于治疗犬肿瘤，但是在国内这方面尚处于市场空白。

程序性细胞死亡受体1(PD-1)，是一个大小约55kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于CD28超家族受体，主要在T细胞、B淋巴细胞和活化的巨噬细胞表面表达。PD-1蛋白有两个配体：PD-L1和PD-L2。在正常生理条件下，PD-1与PD-L1/PD-L2的结合会抑制T细胞的活化，进而保护机体免受自身免疫系统的攻击；但是，多种实体瘤以及一些血液瘤，包括黑色素瘤、乳腺癌、各种消化系统肿瘤、淋巴瘤、白血病等癌细胞也大量表达PD-L1。肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合，抑制T细胞的活化，从而成功逃避机体免疫系统的识别和攻击，实现肿瘤细胞的免疫逃逸。同时研究发现，肿瘤细胞上PD-L1的表达与多个肿瘤类型的不良预后相关。因此阻断PD-1和PD-L1相互作用成为治疗肿瘤的一条有效途径。

CD47-SIRPα(signal-regulatory proteinα)信号通路又被称为“别吃我”信号。SIRPα属于SIRP受体家族蛋白，主要表达于髓系细胞表面(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞以及髓系DC细胞等)，也在神经系统的神经元细胞中表达。CD47是SIRPα最主要的配体，是一种在正常细胞表面广泛表达的跨膜蛋白，分子量大约为50kDa，属于免疫球蛋白超家族。在正常生理条件下，细胞膜上的CD47与巨噬细胞表面的SIRPα结合，进而抑制巨噬细胞的吞噬作用。这种功能可以用于标记“自我”和“非我”，避免引起“误伤”；但是CD47也在各类肿瘤细胞表面高表达，发出“别吃我”信号，从而抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，实现免疫逃逸。因此该靶点也可以作为肿瘤治疗的有效靶点。

目前有一些关于人PD-(L)1和CD47双靶点的专利，但是尚未有犬的PD-(L)1和CD47双靶点的研究报道。

发明内容

本发明的目的是为了提供针对犬的PD-(L)1和CD47双靶点的融合蛋白，该融合蛋白适用于犬的过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的治疗，且无血液毒性，安全性好。本发明还提供了编码如上所述的融合蛋白的核酸，一种含有所述融合蛋白的编码基因的生物材料，一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，一种药物组合物，一种试剂盒，所述融合蛋白、核酸或生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD-L1引起的疾病的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含犬PD-1蛋白胞外区突变体和犬SIRPα蛋白。优选地，所述犬PD-1蛋白胞外区突变体为犬PD-1蛋白胞外区T132L。

优选地，所述融合蛋白包括Fc片段。

本发明第二方面提供编码如上所述的融合蛋白的核酸。