[发明专利]鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用

说明书

本发明公开了鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用。本发明所提供的包含融合蛋白的纳米抗原，所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基和抗原蛋白连接得到；所述斑马鱼铁蛋白H亚基的N端和所述抗原蛋白的C端通过连接肽连接得到；所述抗原蛋白选自鲤春病毒血症抗原蛋白、草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白或鲈鱼弹状病毒抗原蛋白。发明以鱼类自身铁蛋白和抗原蛋白序列进行串联后经大肠杆菌原核表达，制备得到表面展示抗原蛋白的纳米球状粒子，通过浸泡方式可引起鱼体产生广泛中和性抗体，提高了免疫效力，可有效预防鲤春病毒血症、草鱼出血病、鲈鱼弹状病毒病等水产疾病。本发明疫苗制备方法安全、简便，适合进行快速大规模生产。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及鱼类蛋白自组装纳米抗原及其制备的疫苗与应用。

背景技术

近年来，我国已成为世界上最大的水产品生产国和消费国，2020年全国水产养殖产量已达5224.2万吨。人们对水产品的需求量处于逐年增长态势，直接推动了水产养殖业的快速发展，极大地促进了水产养殖业经济发展。而水产病毒性疾病是水产养殖业危害最大的一类疾病，具有发病急、传播快、治疗难、死亡率高和危害大等特点。水产病毒性疾病具有宿主感染范围广、发病急和死亡率高等特点，可以感染几乎所有的鲤科鱼类，患病幼鱼的死亡率在90％以上。因此，水产病害防控已成为制约水产养殖业持续健康发展的关键问题。

疫苗已成为水生动物疾病防治领域研究与开发的主流产品，也是确保水产养殖绿色发展的必然选择。我国自1969年成功制备草鱼土法疫苗以来，历经多年发展，目前已在多种水产病原的土法疫苗、活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗制备上取得了一些突破，并于2011年成功获批了首个渔用疫苗(草鱼出血病活疫苗)国家一类新兽药证书。但是，目前渔用疫苗在大规模产业化应用方面仍然存在一些理论和技术瓶颈，特别是在免疫途径和免疫效果方面。其中，注射免疫保护效果最好，但由于操作技术和生产成本等原因，其难以满足大规模产业化要求；浸浴和口服免疫虽然操作技术简单、生产成本低，但存在体表皮肤和肠道屏障限制作用、酶解失活、免疫保护率低等一系列难以克服的技术问题，大量研究表明纳米材料作为渔用疫苗的载体可有效提高疫苗的免疫保护效果。

近年来，铁蛋白(Ferritin)作为一种纳米材料在多个领域得到应用。铁蛋白是一种广泛存在于生物体中的笼状蛋白，其蛋白外壳由24个铁蛋白亚基自组装而成，其中每三个亚基组成一个三聚体亚单位。铁蛋白的N末端伸向外表面，易于进行基因修饰，融合蛋白多肽。高度有序重复抗原在微生物体表面以5-10nm间隔分布时易于诱导其产生强烈的T细胞依赖的抗体反应。铁蛋白非常稳定，能够耐受高温(70-80℃)和多种变性剂而不被影响天然蛋白结构。铁蛋白对pH敏感，在pH 2.0的酸性条件下蛋白壳发生解体，而当pH恢复到生理条件(pH 7.0)时，解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白。近年来对铁蛋白的研究主要集中在：(1)通过对铁蛋白内表面的修饰使铁蛋白壳内包裹上特定药物或者促进纳米材料的合成；(2)通过对铁蛋白外表面的修饰使其与PEG或抗体连接以扩展新的功能；(3)通过铁蛋白外表面或亚基间接触面的修饰控制铁蛋白的自组装。

发明内容

铁蛋白纳米颗粒展示抗原，能够显著地增强抗原的免疫原性，引起更强的体液、细胞免疫反应，因此本发明以鱼类的铁蛋白H亚基作为抗原的载体。

本发明的一个目的是提供一种包含融合蛋白的纳米抗原。

本发明所提供的包含融合蛋白的纳米抗原，所述融合蛋白由斑马鱼铁蛋白H亚基和抗原蛋白连接得到；所述斑马鱼铁蛋白H亚基的N端和所述抗原蛋白的C端通过连接肽连接得到；所述抗原蛋白选自鲤春病毒血症抗原蛋白、草鱼呼肠孤病毒抗原蛋白或鲈鱼弹状病毒抗原蛋白。

所述鱼类自身铁蛋白为斑马鱼铁蛋白H亚基，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。