[发明专利]一种在微流场中利用化学-酶级联反应生成2-喹啉羧酸的方法及装置

权利要求书

1.一种在微流场中利用化学-酶级联反应生成2-喹啉羧酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：以邻硝基苯甲醛溶解于有机溶剂得到溶液A，丙酮酸钠溶解于磷酸盐的缓冲液得到溶液B，将溶液A、溶液B同时泵入固定有丙酮酸依赖性醛缩酶NahE的第一微通道反应器中，在第一微通道反应器中将邻硝基苯甲醛催化成4-(2-硝基苯基)-2-氧代丁-3-烯酸；

S2：将铁粉固定到第二微通道反应器中，将步骤S1得到的反应液与盐酸溶液混合调整pH为2~4后，注射到第二微通道反应器中，从而将4-(2-硝基苯基)-2-氧代丁-3-烯酸还原得到2-喹啉羧酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述丙酮酸依赖性醛缩酶NahE为来源于Pseudomonas putida的反式-o-羟基亚苄基丙酮酸水合酶-醛缩酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，溶液A和溶液B的摩尔比为1∶1～3。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，丙酮酸依赖性醛缩酶NahE通过如下方法制备：将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的丙酮酸依赖性醛缩酶NahE的基因构建到pET-28a（+）载体上，并转入到大肠杆菌BL 21（DE 3）中，培养并纯化得到对应的丙酮酸依赖性醛缩酶NahE。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，丙酮酸依赖性醛缩酶NahE通过如下方法固定在第一微通道中：将培养并纯化得到的醛缩酶酶分散于浸有树脂的磷酸盐缓冲液中，于20~22℃下缓慢搅拌后，取出树脂，于冻干机中除水，然后将干燥的固定化树脂填充到微通道中；将定量的铁粉与水混合的悬浊液快速通入管道内，再将管道缠绕在磁铁上从而固定微通道内的铁粉。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述树脂为水性吸附树脂ES-1、ES-103B和ES-108中的任意一种；树脂、丙酮酸依赖性醛缩酶NahE纯酶的用量比为500~1500 mg：1 mg。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述有机溶剂为正庚烷、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二甲基亚砜中的任意一种或几种；盐酸溶液浓度为50 mM；磷酸盐的缓冲溶液为KH₂PO₄/K₂HPO₄或NaH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH值为6～8，缓冲溶液中磷酸盐的总浓度为50mmol·L^-1～200 mmol·L^-1。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，反应的温度为25~35℃，反应的停留时间为15~60 min，反应器中的管道为聚四氟乙烯管，内径为2~3mm，管道体积为2~4ml；步骤S2中，反应的温度为85~100℃，反应的停留时间为30~60 min，反应器中的管道为聚四氟乙烯管，内径为2~3 mm，管道体积为2~4 ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1和S2中所述邻硝基苯甲醛、NahE、铁粉的用量比为50~150 mM：1 mg：500 mg。

10.一种在微流场中利用化学-酶级联反应生成2-喹啉羧酸的装置，其特征在于，所述装置包括第一进料泵、第二进料泵、第三进料泵、第一微通道反应器和第二微通道反应器；其中，第一进料泵和第二进料泵通过管道以并联的方式连接到第一微通道反应器上，所述第一微通道反应器与第二微通道反应器串联，所述第三进料泵与第二微通道反应器相连；所述第一微通道反应器中固定有丙酮酸依赖性醛缩酶NahE；所述第二微通道反应器中固定有铁粉。