[发明专利]一种猪塞尼卡谷病毒病灭活疫苗的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种猪塞尼卡谷病毒病灭活疫苗制备方法及其应用，该疫苗采用悬浮培养塞尼卡谷病毒、层析方法纯化抗原、采用优化的水佐剂制备疫苗，本方法制备的塞尼卡谷病毒灭活疫苗安全性好，能够诱导仔猪产生高水平的中和抗体，有效的保护猪群免受猪塞尼卡谷病毒强毒的攻击。

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种猪塞尼卡谷病毒病灭活疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

SVV是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病(swine idiopathic vesiculardisease,SIVD))及流行性暂时性新生仔猪损失(epidemic transient neonatal losses,ETNL)急性病原微生物，该病发病率高，病程快，传播速度快，死亡率较低，但仔猪死亡率高。临床上主要表现为猪鼻镜、蹄部冠状带水泡、溃烂，跛足、嗜睡，新生仔猪腹泻及急性死亡等症状。2015年，我国广东地区首发塞内加谷疫情，在2016及2017年，塞内加谷疫情继续蔓延，在我国多个省市暴发，疫情范围波及广东、福建、湖南、河南、黑龙江等省份，临床症状以水疱类病变为特点，偶见低日龄仔猪大量死亡，给养猪业带来巨大经济损失，严重威胁了我国的公共卫生安全及养殖业发展。

目前关于该病的防控尚无可用的生物疫苗制品。目前，猪塞尼卡谷病的防控依赖于猪场有效管理，但国内养猪模式复杂多样，猪场管理较为落后，因此研制相应的生物制品防控该疫病的暴发流行十分迫切。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是针对现有塞尼卡谷病毒生物制品的不足，提供一种有效安全的塞尼卡谷病毒病疫苗大量制备方法；该灭活疫苗所采用的制备方法简单安全，疫苗免疫效果良好。

(二)技术方案：

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供一种猪塞尼卡谷病毒病灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

1)病毒液制备所述猪塞尼卡谷病毒抗原的具体制备过程如下：以生物反应器制备悬浮BHK-21细胞，待细胞密度3.0～5.0×10⁶cells/ml，以MOI 0.001～0.1剂量接种塞尼卡谷种毒，接毒后生物反应器控制参数设定为DO 30～60％、pH7.0～7.4、搅拌转速80～100rpm/min、温度36.5～37.5℃，期间定时取样，以0.4％台盼蓝染色观察细胞病变情况，待细胞活率≤20％时，收获悬浮培养病毒液。

2)抗原纯化上述收获悬浮培养病毒液经3次反复冻融后，采用连续流离心的方法，病毒液在8000rpm离心30min，弃去细胞碎片沉淀，收集离心上清液。上清液经过500KD中空纤维柱进行反复3次洗滤，收集粗纯病毒液。再经分子筛层析凝胶纯化进行精纯处理，收获塞尼卡谷纯化病毒液。

3)灭活具体过程如下：将除菌过滤的BEI溶液按2％体积加入猪塞尼卡谷纯化病毒液中，使BEI终浓度为0.08％，充分混匀后倒罐，待温度升至30℃后开始计时，灭活36小时，每隔120分钟搅拌1次。计时结束后将过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其终浓度为2％，充分混匀后，灭活后抗原放置2～8℃保存。

疫苗配制

将灭活后猪塞尼卡谷抗原缓慢加入的所述聚合物水性佐剂中，聚合物水性佐剂的量为抗原质量的50％，控制搅拌速度2000转/分，搅拌温度25度以下，抗原和佐剂分散均匀完成后，进行分装标记，即得猪塞尼卡谷水佐剂灭活疫苗。

本发明佐剂制备

所述聚合物水性佐剂由下述质量百分含量的组分组成：

优选的，所述聚合物水性佐剂由下述质量百分含量的组分组成：