[发明专利]牙鲆黏蛋白Muc2特异性抗体制备及应用

说明书

本发明提供一种牙鲆黏蛋白Muc2的特异性抗体及其应用，所提供的抗Muc2特异性抗体可用于检测牙鲆黏蛋白Muc2及其阳性黏液细胞，为进一步了解黏液细胞在牙鲆黏膜免疫应答中的作用提供了有力支撑。本发明筛选获得了牙鲆黏蛋白Muc2基因的B细胞抗原表位VYRQDRSECTCLE，偶联KLH后免疫Balb/c小鼠，从而制备了牙鲆Muc2特异性抗体，为检测牙鲆Muc2蛋白分子及其阳性黏液细胞创造了关键工具。

技术领域

本发明属于鱼类分子免疫学技术领域，具体涉及一种牙鲆(Paralichthysolivaceus)黏蛋白Muc2的特异性抗体及其制备方法和应用。

背景技术

鱼类的黏膜系统作为一种古老而复杂的免疫防线，时刻受到外界的物理、化学与微生物刺激。其中鱼类鳃、肠和皮肤等部位的黏液细胞所分泌的黏液可提供润滑、细胞信号通路及化学屏障的功能。黏液形成致密的网状结构覆盖在上皮层，其中富含的抗菌肽、抗体、凝集素等免疫因子可有效抑制黏膜病原微生物的繁殖与侵染，黏液层不断更新代谢，规律性地将病原排出体外。相比于陆生动物，鱼类的体表黏液在黏膜免疫防御中具有更重要的意义。

黏蛋白是黏液的主要组成成分，分为跨膜型黏蛋白和胶形成型黏蛋白。Muc2是一种典型的胶形成型黏蛋白，其由黏液细胞分泌后体积迅速扩大，成为具有网格结构的胶状骨架，天然免疫因子可透过网状间隙作用于黏蛋白糖链上附着的病原菌。因此，黏蛋白Muc2对于维持黏膜稳态至关重要。目前，已获得了人类、小鼠等多种高等脊椎动物Muc2特异性抗体，以其为研究工具扩展了我们对Muc2功能特性的了解。人类黏液Muc2异常表达是多种疾病的标志，常被作为疾病免疫治疗和免疫诊断的靶标。近年来，鱼类黏蛋白研究也成为探究鱼类黏液细胞和黏膜免疫系统功能与机制的突破点，但是，由于示踪黏蛋白Muc2的关键免疫学试剂的缺乏，相关研究止步于黏液Muc2高分子糖链层面，在蛋白层面的研究工作仍属空白，阻碍了对鱼类Muc2特性及其黏膜防御功能以及黏液细胞免疫学功能研究的进展。因此，解析鱼类Muc2基因结构与特性，筛选抗原性高的氨基酸序列用于合成多肽，进而研制高效的Muc2特异性抗体制剂，对深入理解Muc2作为屏障和生化活性蛋白的分子功能，探究其与鱼类疾病发生的关系，推动鱼类黏膜免疫防御机制的研究至关重要。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中国名优经济鱼类，但病害问题给牙鲆养殖业造成重大经济损失。本发明通过克隆牙鲆Muc2基因并制备特异性抗体，将其作为识别牙鲆黏液细胞以及黏蛋白的探针，应用于检测鱼类疾病或疫苗接种诱发的黏蛋白数量变化、评估黏液细胞状态及免疫应答水平等，为深入研究鱼类黏膜免疫防御机制及疾病免疫诊断提供有力工具，为新型鱼用黏膜疫苗研制提供重要支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种牙鲆黏蛋白Muc2的特异性抗体及其制备方法和应用，所提供的牙鲆Muc2特异性抗体可用于检测牙鲆黏膜组织中的黏蛋白Muc2及Muc2阳性黏液细胞，为研究牙鲆黏液细胞及黏蛋白的应答变化，深入了解黏液细胞和黏液在固有黏膜免疫中的作用及其与疾病发生的关系提供重要工具。

本发明提供一种用于制备牙鲆Muc2特异性抗体的B细胞抗原表位多肽，其具体的氨基酸序列为VYRQDRSECTCLE(SEQ ID NO:1)；

本发明还保护上述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的B细胞抗原表位多肽的衍生多肽，即通过取代、缺失、添加一个或几个氨基酸所获得的多肽；

本发明还保护一种偶联蛋白，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的B细胞抗原表位多肽的5′端或3′端偶联有用于增强免疫效果的分子；

本发明还提供一种特异性抗体，所述的特异性抗体是使用上述的抗原多肽免疫动物制备的；

所述的动物，作为实施例的具体记载，为Balb/c小鼠；

本发明中特异性抗体的制备方法，是将牙鲆Muc2的B细胞抗原表位与载体偶联后，免疫Balb/c小鼠，取血清后处理得到抗牙鲆Muc2特异性抗体。