[发明专利]一种无模板DNA酶促合成方法

权利要求书

1.一种无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将TdT酶和引发链分别固定在反应面板上的反应孔底部，调节第一反应缓冲液的pH值，使所述TdT酶完全没有催化活性，所述TdT酶的结合结构域不受影响；

(2)加入单一、设定量、预设的脱氧核苷酸，所述脱氧核苷酸与第二反应缓冲液混合加入，让脱氧核苷酸扩散到反应孔中，并且让TdT酶反应位置上只结合一个dNTP，此时TdT酶是非活性状态且不进行催化连接反应，dNTP只是占据了TDT酶的结合结构域以防止多余的dNTP连接到该位置；

(3)用第三反应缓冲液冲洗掉所有没有结合上去的dNTP，然后更换第四反应缓冲液，使TdT酶激活，从而催化dNTP连接反应开启，一个核苷酸就被成功加到了DNA反应链的末端，继续下一个循环。

2.根据权利要求1所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于：所述第一反应缓冲液为pH4.5～pH6.0或者pH8.0～pH10.0的50mmol/L的Tris-HCl；所述第二反应缓冲液，由pH＝8.9的50mmol/L的Tris-HCl、0.25mg/ml的BSA、体积份数为5份的DMSO、和1.5mM的MgCl₂组成；所述第三反应缓冲液，由pH为8.0的100mmol/L的Tris-HCI、pH为8.0的20mmol/L的EDTA和1.4mol/L的NaCl组成；所述第四反应缓冲液由pH为7.2的0.2mol/L的二甲胂酸钾、10mM的MgO₄C₄H₆、1mM的2-巯基乙醇、0.5mg/ml的BSA、1mM的dNTP组成。

3.根据权利要求1所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于：步骤(1)中所述反应面板上设置若干个反应孔，所述反应孔直径范围在1.5微米-2.5微米，每个反应孔可以固定多个TdT酶分子进行反应，所述反应孔在反应面板上形成矩阵排列，所述反应面板上含有多个反应孔矩阵。

4.根据权利要求3所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述反应孔底部布设涂层，所述涂层材料为含有羧基的聚甲基丙烯酸，在反应孔底部连接上一个生物素，在所述生物素分子链的末端修饰化学活性基团以取代生物素分子链末端的羧基，所述化学活性基团可以为羟基，所述生物素与反应孔底部涂层材料通过羧基和羟基的酯化反应而修饰在反应孔底部；然后将亲和素家族分子的一个结合位点与反应孔中的生物素结合，另一结合位点与TdT酶结合。

5.根据权利要求4所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述生物素为维生素H，其结构式为

6.根据权利要求4所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述亲和素可以为链霉亲和素、中性亲和素。

7.根据权利要求1所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中调节第一反应缓冲液的pH值为4.5-6.0或者8.0-10.0。

8.根据权利要求1所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述步骤(3)中第四反应缓冲液的pH值为6.5-7.5。

9.根据权利要求1-8任一项所述的无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，所述反应孔底部材料为玻璃纤维，将反应孔底部带上可控的正电荷，由于DNA带负电荷，从而带正电荷的玻璃纤维吸附住带负电荷的DNA，所述正电荷的电量大小根据核苷酸延伸可调节，每完成一轮新的合成，带正电荷的反应孔吸附住延伸中的DNA链，而单个核苷酸由于带电量比较小，将被反应缓冲液冲洗时冲走；在冲洗过程中，加大电压、电流，提高反应产物结合在底部的力量，耐受比较严苛的生化反应和冲洗方式。

10.根据权利要求4所述无模板DNA酶促合成方法，其特征在于，引发链为一个长度大于3nt并且小于100nt末端带有羟基的引发链，所述引发链为(T)n、(A)n、(C)n、(G)n，其中T代表脱氧胸腺嘧啶核苷酸，简称脱氧胸苷，A代表脱氧腺嘌呤核苷酸简称脱氧腺苷，C代表脱氧胞嘧啶核苷酸简称脱氧胞苷，G代表脱氧鸟嘌呤核苷酸，简称脱氧鸟苷，n范围为3～100；所述带有羟基的引发链与反应孔底部涂层材料通过羧基和羟基的酯化反应而修饰在反应孔底部；每个反应孔中将TDT酶和引发链按一定比例20:1～5:1固定在反应孔底部，使多个TDT酶围绕一个引发链，使引发链接触到TDT酶催化中心，从而使每个反应孔底部的引发链获得TdT酶的催化反应。