[发明专利]一种无模板DNA酶促合成方法

说明书

本发明涉及一种无模板DNA酶促合成方法，包括将TdT酶和引发链分别固定在反应面板上的反应孔底部，调节第一反应缓冲液的pH值，使所述TdT酶完全没有催化活性，所述TdT酶的结合结构域不受影响；加入单一、设定量、预设的脱氧核苷酸，所述脱氧核苷酸与第二反应缓冲液混合加入，让脱氧核苷酸扩散到反应孔中，并且让TdT酶反应位置上只结合一个dNTP，此时TdT酶是非活性状态且不进行催化连接反应，dNTP只是占据了TdT酶的结合结构域以防止多余的dNTP连接到该位置；用第三反应缓冲液冲洗掉所有没有结合上去的dNTP，然后更换第四反应缓冲液，使TdT酶激活，从而催化dNTP连接反应开启，一个核苷酸就被成功加到了DNA反应链的末端，继续下一个循环。本发明可以延伸DNA链超过300nt。

技术领域

本发明涉及DNA合成领域，特别涉及一种无模板DNA酶促合成方法。

背景技术

近年来，合成生物学在医疗、化工、农业及信息等交叉融合领域实现快速发展，极大地提高了人类探索生命本质并改造利用的能力，作为生命科学基础的DNA合成是合成生物学的基础性技术。DNA，包括DNA药物，DNA存储等都是研究的热门领域。RNA方面，最主要包括mRNA疫苗和mRNA药物等，对mRNA疫苗的需求催生了这个领域的快速发展，所以对RNA合成技术也提出了新需求另一方面，mRNA疫苗的开发和成果又让更多的人发现mRNA疗法在其他重要的疾病中的潜在应用价值。所以DNA合成和RNA合成技术受到了各国政府和资本的重视，各种新技术喷涌而出，尤其对于绿色的酶促合成更是下一个10年的重点发展对象。

简而言之，DNA酶促合成进行的如火如荼，目前代表公司主要有MolecularAssemblies，DNA script，Ansa biotechnology等。

三代基于生物酶法合成技术(如TdT酶合成法)由于反应条件温和，准确率高，又相对环保，从2008年开始就陆续在欧美国家出现一系列产业布局，但总体仍处于原理验证阶段，尚未出现商业化设备。国内对该领域的布局较晚，截止目前为止，只有天津工业生物技术研究所和天津科技大学生物工程学院，湖南大学目前有TdT酶相关的DNA合成技术研发报道(Ref：彭凯等，DNA合成、组装与纠错技术研究进展)，到目前为止没有人在研发生物酶DNA合成仪设备。国际上，目前主流生物酶法合成公司包括Molecular Assemblies,Nuclera,DNA Script,Ansa Biotechnoligies等，基本都是基于TdT酶(末端脱氧核苷酸转移酶)，由于TdT酶合成无需依赖模板，仅使用单链DNA即可进行DNA合成，所以具有从头创造基因组材料的功能，使得他成为三代DNA合成的关键生物酶。合成策略方面，主要通过修饰核苷酸，添加特定化学基团的试剂来终止反应，或者偶联TdT酶与核苷酸等。三代合成技术存在的问题包括前期修饰和制备原料工艺流程复杂，有些成分改造难度大，无法严格控制碱基的添加和终止等，还在进一步优化改造阶段。

其中，Ansa Biotechnoligies公司则使用TdT-dNTP复合物来主导天然碱基的原位合成。相比于MolecularAssemblies等公司，其使用的是天然dNTP-TdT的偶联物，由于空间位阻的原因，当一个dNTP倍加到合成链的末端以后，由于空间位阻的原因，下一个dNTP就进不来，反应就会停下来，如此就能根据反应预设的，一个一个往后添加设计的核苷酸序列。但是这个方案最大的弊端是TdT酶消耗量太大了，因为当dNTP结合上去以后，需要去偶联，把TdT酶去掉。