[发明专利]用于检测EGFR基因的引物探针组合及试剂盒和方法

说明书

本发明公开了用于检测EGFR基因的引物探针组合及试剂盒和方法。所述引物探针组合包括用于检测T790M的突变型引物和突变型探针，以及野生型探针；所述突变型引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列；所述突变型探针的序列包括如SEQ ID NO.3所示序列；所述野生型探针的序列包括如SEQ ID NO.4所示序列。本发明通过T790M突变型的探针和野生型的探针联合，能检测到T790M位点的单独分型，且灵敏度、准确性均比较高，能检测到肿瘤组织各处来源的T790M异常基因，提供了一种无创性肿瘤诊断的新方法，也为肿瘤早期诊断提供了新的希望。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于检测EGFR基因的引物探针组合及试剂盒和方法。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)基因突变是东亚人群中非小细胞肺癌(NSCLC)最常见的驱动基因突变，突变率为30％～40％。既以往多项研究支持EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗是EGFR基因突变局部晚期或转移NSCLC患者的标准治疗方案，但几乎所有服用EGFR-TKI的患者最终都会出现耐药，其中EGFR基因第20号外显子发生错义突变，20号外显子第790号位置上的甲硫氢酸(M)替代苏氨酸(T)(T790M突变)是耐药突变中最主要的类型。目前已报道的EGFR-TKI耐药后组织样本的T790M突变阳性率基本在60％左右，血浆样本T790M突变阳性率基于不同方法差别较大，在23％～63％。目前，美国国立综合癌症网络(NCCN)、欧洲临床肿瘤协会(ESMO)指南、中国临床肿瘤学会(CSCO)原发性肺癌诊疗指南均推荐奥希替尼为局部晚期或转移NSCLC EGFR-TKI耐药后T790M突变阳性患者的标准治疗。EGFR基因T790M突变检测对EGFR-TKI耐药的晚期NSCLC患者后续治疗具有重要的临床指导意义。

目前基因突变常用的检测方法包括：sanger测序法、荧光PCR法、高分辨溶解曲线法、高通量测序法等。sanger测序法过程操作繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高，并且由于自身的限制导致其灵敏度不高，仅可检测丰度超过20％的突变，假阴性较多。高通量测序法价格昂贵，读长大约30-250bp，比Sanger测序短，对序列拼接造成了负担，检测结果仍需要Sanger测序验证，并且对于检测外显子与内含子交界区的小片段缺失的准确性不够。高通量测序法操作繁琐，限制了测序速度。传统荧光PCR法操作简单，能极大的避免扩增产物的污染。但该方法不能实现精准定量，尤其是低丰度突变。

数字PCR(digital PCR，dPCR)技术，即通过将一个样本分成大量等份，然后分配到不同的独立反应，每个独立反应单元至少包含一个拷贝的目标分子(核酸模板)，在每个独立反应的中分别对目的模板分子进行PCR扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。目前数字PCR主要在癌症标志物、稀有突变检测、致病微生物检测、基因表达分析以及拷贝数变异分析等科研领域有较广泛的应用，同时也可以与高通量测序无缝对接，验证测序结果。

市面已有试剂盒的问题(图1)：1)FAM通道存在非特异性扩增；2)阴阳性区分不明显；3)标准品中阳性与非特异性荧光值条带合并，突变比例错误。

为了解决现有技术中存在的问题，因此急需要一种特异性检测EGFR基因的引物探针组合、试剂盒，防止PCR产物造成的假阳性，并提高检出的特异性和准确性。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供检测EGFR基因的引物探针组合及试剂盒和方法，以期解决现有技术中Taqman探针在特异性结合目的序列时无法达到100％的特异性结合，导致无法精准判断是否存在基因突变，以及cfDNA成分复杂、目的核酸含量低等特点，导致靶基因浓度低于检测限时能造成假阴性结果的问题。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

本发明的第一方面保护检测EGFR基因的引物探针组合，包括用于检测T790M的突变型引物和突变型探针，以及野生型探针；