[发明专利]生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌含有α-半乳糖苷酶基因(agal)、木糖还原酶基因(XR)、甘露醇脱氢酶基因(MDH)、S136A突变的L-半乳糖脱氢酶基因(LGDH)、D-阿拉伯糖-1,4-内酯氧化酶基因(ALO)和蔗糖磷酸化酶基因(SPase)。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述α-半乳糖苷酶基因(agal)来自于Meiothermus ruber，蛋白序列如SEQ ID NO.1所示；所述木糖还原酶基因(XR)来自于Hypocrea jecorina，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示；所述甘露醇脱氢酶基因(MDH)来自于Apium graveolens，蛋白序列如SEQ ID NO.3所示；所述S136A突变的L-半乳糖脱氢酶基因(LGDH)来自于拟南芥，蛋白序列如SEQ ID NO.4所示；所述D-阿拉伯糖-1,4-内酯氧化酶基因(ALO)来自于毕赤酵母，蛋白序列如SEQ ID NO.5所示；所述蔗糖磷酸化酶基因(SPase)来自于Bifidobacterium longum，蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌含有载体，所述α-半乳糖苷酶基因(agal)、木糖还原酶基因(XR)、甘露醇脱氢酶基因(MDH)、S136A突变的L-半乳糖脱氢酶基因(LGDH)、D-阿拉伯糖-1,4-内酯氧化酶基因(ALO)和蔗糖磷酸化酶基因(SPase)被包括在所述载体上。

4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是选自：毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或者大肠杆菌(Escherichiacoli)。

5.如权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：分别以XR基因序列、MDH基因序列、LGDH基因序列和ALO基因序列作为模板，加入各自的上下游引物，通过常规PCR分别扩增得到rXR片段、rMDH片段、rLGDH片段和rALO片段；将各扩增片段连接至载体的多克隆位点之间，获得XR-MDH-LGDH-ALO重组质粒；

分别以agal基因序列和SPase基因序列作为模板，加入各自的上下游引物，通过常规PCR分别扩增得到ragal片段和rSPase片段；将各扩增片段连接至载体的多克隆位点之间，获得agal-SPase重组质粒；

将两种重组质粒线性化后，整合至毕赤酵母基因组中，筛选得到同时表达agal、XR、MDH、LGDH、ALO和SPase的毕赤酵母重组菌株。