[发明专利]生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生产2‑O‑α‑D‑吡喃葡萄糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)的基因工程菌，以及该基因工程菌的构建方法和应用。本发明所述的生产2‑O‑α‑D‑吡喃葡萄糖基‑L‑抗坏血酸(AA‑2G)的基因工程菌，含有α‑半乳糖苷酶基因(agal)、木糖还原酶基因(XR)、甘露醇脱氢酶基因(MDH)、S136A突变的L‑半乳糖脱氢酶基因(LGDH)、D‑阿拉伯糖‑1,4‑内酯氧化酶基因(ALO)和蔗糖磷酸化酶基因(SPase)。本发明提供了利用该重组基因工程菌生产AA‑2G的方法。该基因工程菌株实现了全细胞合成AA‑2G,大大缩短AA‑2G的合成生产途径，提高了AA‑2G的产率。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的基因工程菌，以及该基因工程菌的构建方法和应用。

背景技术

L-抗坏血酸(LAA)，又称维生素C，是一种必需的营养素，其参与多种生理活动，对维持和促进人体健康起着重要作用。由于人类不能合成LAA，必须通过日常饮食获得。然而，LAA在水溶液中极不稳定，在氧、热、光和金属离子的作用下容易被氧化，由于LAA的不稳定性直接降低了其生物活性，限制了它的应用，因此制备一种新的LAA替代品，改善氧化稳定性的同时保留LAA的生物活性，一直是学术界和工业界的研究热点。

各种LAA衍生物，如抗坏血酸(酰基、-磷酸和-硫酸)、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸甲醚和抗坏血酸葡糖苷已被化学或生物合成。在LAA衍生物中，2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)被认为是优越的，因为它具有优良的耐光、耐热、耐氧化性，而且容易被α-葡萄糖苷酶降解而生成LAA和葡萄糖，因此，AA-2G在医药、食品和化妆品行业有广泛的用途。

目前工业上生产AA-2G的方法是以LAA为原料，由糖基转移酶的酶促转糖基化合成。据报道，目前发现的糖基转移酶包括α-葡萄糖苷酶(US3763009，1973年)、环糊精糖基转移酶(CGTase)(US5084563，1992年；US5137723，1992年；US5407812，1995年和US9265781B2，2016年)、α-淀粉酶、蔗糖磷酸化酶和α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(US20060216792，2006年；US8759030，2014年和CN201510179664，2015年)和葡聚糖蔗糖酶。目前AA-2G的工业生产过程是涉及两个独立生产单元，和化学过程和生物过程的混合体系。

已公开专利中关于AA-2G的微生物发酵合成主要集中在：1.以LAA和糖基供体如麦芽糖，蔗糖和环糊精等作为反应底物加入到反应体系中，以不同来源的重组糖基转移酶作为催化剂合成AA-2G，如授权公告号：CN 108913641 B“一种重组大肠杆菌及其应用”；授权公告号CN 109988778 B“一种蔗糖磷酸化酶基因及其应用”。2.采用定点突变技术对糖基转移酶进行关键位点的突变，以期催化合成的AA-2G转化率高、收率高。如授权公告号：CN108018268 B“一种提高AA-2G产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体”；授权公告号：CN104531629B“一种提高AA-2G转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体”。3.寻找新的催化酶，以期催化合成的产物单一，副产物少。如美国专利US20060216792(2006)和US8759030(2014)报道了采用来源于球状节杆菌α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶为催化剂制备AA-2G。虽然这些专利以不同的策略提高AA-2G的产率，但从根本上生产过程所带来的时间、物料和能量的消耗问题越来越突出。为了克服这些问题，最好将AA-2G生产的模式从化学工艺和生物工艺的混合转变为完全的生物工艺。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的基因工程菌，该基因工程菌能以廉价的棉子糖(又称蜜三糖)为合成原料全细胞合成AA-2G，整个合成过程不涉及化学过程，属于完全的生物合成，从而改革了AA-2G的合成工艺，解决了目前生产AA-2G的高污染高能耗的化学过程问题。