[发明专利]基于LAMP的核酸检测微芯片及制备使用方法

说明书

本发明公开了涉及微芯片检测微生物技术领域，具体涉及基于LAMP的核酸检测微芯片及制备使用方法，该方法将显色微芯片设计适配于最大可能数计算。然后将根据设计切割的基础层、样品层和间隔层依次粘合、和干燥，得到核酸定量显色微芯片。将梯度稀释后LAMP样品加入样品层的样品孔中，在间隔层附上矿物油，得到待测核酸定量微芯片样品。将所述核酸定量微芯片样品在平板PCR仪或其他恒温加热装置上进行等温扩增反应，根据样品孔中显色判断阴性或阳性数，计算最大可能数结果，定量样品核酸浓度。本发明属于核酸原位定量技术，本发明的方法制备过程简单，易于操作，灵敏度高，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及微芯片检测微生物技术领域，具体涉及基于LAMP的核酸检测微芯片及制备使用方法。

背景技术

核酸检测微芯片因其体积小、使用简便在环境检测、食品加工等众多领域有重要应用。随着各种新材料、新手段、新设计在核酸检测微芯片上的应用，对具有制备简便、原位使用的核酸检测微芯片研究越来越受到关注。近年来，环介导等温扩增技术(LAMP)因其反应时间段、终点检测简便，被越来越多用于核酸检测中。LAMP的灵敏度很高，因为它能容忍水中常见的聚合酶链式反应PCR抑制剂。此外，LAMP反应可以在55℃至65℃等温条件下进行，因此，可以使用普通的实验室水浴或加热块代替昂贵热循环仪设备。此外，与传统的PCR不同，如果在LAMP试剂中加入DNA插层染料，LAMP扩增引起的终点颜色变化很容易用肉眼确认。因此，LAMP认为可以是一种替代PCR的核酸检测工具，应用于各种领域的原位检测。然而，和传统PCR一样，LAMP的终点指示只能用于定性，而无法用于定量。在环境检测等领域应用时亟待解决基于LAMP方法的简便定量方法。

有鉴于此，本发明提供一种基于LAMP的核酸检测微芯片及制备使用方法。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供基于LAMP的核酸检测微芯片及制备使用方法，该方法基于最大可能数量(MPN)计算，提供了实现便捷、快速定量微生物核酸的显色核酸检测微芯片。

为了解决上述技术问题，采用如下技术方案：

基于LAMP的核酸检测微芯片，所述核酸检测微芯片包括基础层、样品层和间隔层，所述基础层、样品层和间隔层依次使用粘合、固化和干燥后得到。

进一步，所述样品层为适配于最大可能数计算的多排、相互独立多个样品孔组合而成。

进一步，所述样品孔为圆孔，所述样品孔的直径为0.8-1.5毫米，所述样品孔以矩阵形式排列，所述样品孔之间间距为1.5-2.5毫米。

进一步，所述基础层、样品层和间隔层均由PMMA材料制成，所述PMMA为聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA板先通过激光切割后，然后用70％的乙醇清洗，干燥后得到所述基础层、样品层和间隔层。

进一步，所述基础层为白色，所述基础层的厚度为1.5-3mm，所述样品层和所述间隔层均为透明色，所述样品层和所述间隔层的厚度均为0.8-1.5mm。

进一步，所述核酸检测微芯片使用紫外固化光学胶NOA65粘合固化，并在长波紫外线下暴露5-6min。

进一步，所述核酸检测微芯片的干燥温度为50-70℃，所述核酸检测微芯片的干燥时间为8-24h。

基于LAMP的核酸检测微芯片的制备使用方法，包括以下步骤：

(1)先将核酸检测微芯片设计适配于最大可能数计算，然后将符合设计的基础层、样品层和间隔层组合得到所述核酸检测微芯片；

(2)将梯度稀释后LAMP样品加入所述样品层的样品孔中，进行环介导等温扩增反应，根据不同梯度稀释阴性或阳性数，所述阴性或阳性数的结果进行最大可能数计算，作为核酸定量检测，得到定量核酸浓度。