[发明专利]一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括PmA153包被的固相载体；PmA153的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括标准阳性对照血清和标准阴性对照血清；所述标准阳性对照血清是由使用牛源多杀性巴氏杆菌荚膜A型菌株免疫牛获得；所述标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌荚膜A型的牛血清。

3.根据权利要求2所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括酶标二抗、显色液、终止液、浓缩洗涤液和样品稀释液。

4.根据权利要求3所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG；所述显色液为双组分TMB显色液；所述终止液为硫酸溶液；所述浓缩洗涤液为PBST洗涤液；所述样品稀释液为含牛血清白蛋白、吐温-20、EDTA和氯化钠的PBS液。

5.根据权利要求4所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，其判定标准为：待检样品的S/P值≥0.161时，判为阳性；待检样品的S/P值＜0.161时，判为阴性；S/P值的计算方法为：(样品OD₄₅₀值－标准阴性对照血清OD₄₅₀均值)/(标准阳性对照血清OD₄₅₀均值－标准阴性对照血清OD₄₅₀均值)；OD₄₅₀是指在450nm波长下光密度；且标准阳性对照血清OD₄₅₀值均≥2.0，标准阴性对照血清OD₄₅₀值均＜0.25。

6.一种抗原蛋白在制备特异性检测牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型的试剂盒中的应用，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括PmA153包被的固相载体的制备步骤：

S1抗原蛋白的获取：将序列如SEQ ID NO.1所示的基因整合到表达载体上，获得重组质粒；将重组质粒转入宿主菌，诱导宿主菌表达抗原蛋白；再经菌体破碎、离心取上清以及纯化获得PmA153。

S2包被：配制含PmA153的包被液，使包被液于固相载体接触并孵育，再经封闭处理后，获得PmA153包被的固相载体。

8.根据权利要求7所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在S1抗原蛋白的获取中，表达载体为pET30a；诱导宿主菌表达抗原蛋白的试剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷；宿主菌为Rosseta DE3；纯化的方式为通过Ni-NTASuperflow Cartridges His亲和层析柱纯化。

9.根据权利要求8所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在S2包被中，包被液中PmA153的含量为10μg/mL，孵育条件为4℃8-12h；封闭处理为使用无蛋白封闭缓冲液37℃封闭2h。

10.根据权利要求8所述的一种牛多杀性巴氏杆菌荚膜A型ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括标准阳性对照血清的制备步骤：使用牛源多杀性巴氏杆菌A型菌株的灭活疫苗免疫健康牛，14天后进行一次加强免疫，并于加强免疫后1月采集血清获得标准阳性对照血清。