[发明专利]一种基于ATP生物发光的中药材中微生物总量快速检测方法

说明书

本发明提供了一种基于ATP生物发光的中药材中微生物总量快速检测方法，将待测中药材的校正集样品加入至缓冲液中，进行预增菌处理后，将菌液、助剂与荧光素酶制剂混合均匀后检测相对发光强度；以平均相对发光强度值或平均相对发光强度值的对数值为纵坐标，以微生物总量的对数值为横坐标，绘制微生物含量分布图；以微生物限度划定纵向合格限，以误判率划定预警限，进行分区；通过平均相对发光强度在所述的微生物含量分布图中的位置来判断检测结果是否合格。本发明所述的基于ATP生物发光的中药材中微生物总量快速检测方法具有测试速度快，检测成本低，灵敏度高等优势，适合用于多种中药材品种的现场微生物总量检测中。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其是涉及一种基于ATP生物发光的中药材中微生物总量快速检测方法。

背景技术

中药饮片是中药材经炮制处理，用于调剂，制剂和临床需要的一类中药产品。中药饮片是中药产业三大支柱之一，饮片质量问题直接关系产业稳定发展。由于中药材原料来源不稳定，炮制工艺多样以及饮片储藏和运输环节等因素，导致饮片微生物污染风险加剧。中药饮片整体微生物污染问题较为严重，存在较高微生物安全风险，其中需氧菌、霉菌和酵母菌总数，大肠埃希菌和沙门菌污染问题是中药饮片微生物安全质量控制面临的主要问题之一。

目前，培养计数法是微生物检测的金标准，同时被各国药典采纳作为微生物检查常规方法。但是鉴于微生物生长的周期性及存在不可培养情况，培养法存在检测速度慢和无法检测到不可培养微生物等缺陷。2020版《中国药典》新增了“1021细菌DNA特征序列鉴定法”用于药品质量控制中微生物的鉴定分类，但是该方法存在检测成本较高和定量准确度较差等不足，导致其不适用于需氧菌总数检查。

三磷酸腺苷(ATP)生物发光法是一种基于微生物体内ATP引发荧光素酶反应而产生荧光信号，从而实现微生物快速检测的方法。ATP存在于一切活细胞内，单个活细菌ATP一般稳定在10^-18mol。在荧光素酶反应体系下，包括荧光素酶，镁离子，荧光素和氧气，一旦微生物细胞体内的ATP释放，便会引发酶促反应，并且释放荧光。ATP生物发光技术就是基于荧光素酶促反应原理，将微生物体内的ATP转化为光子，再利用光度计收集光子信号转换为相对光单位(RLU)，作为微生物定量检测的依据。该方法需要在有氧条件下进行检测，几乎可以检测到所有活的需氧菌，而且从样品前处理到获得测试结果不超过十分钟，适用于样品中微生物总量快速检测。

目前ATP生物发光法已被列入我国食品接触表面消毒效果评价的国家标准，例如“GB/T 36004-2018食品接触表面清洗消毒效果试验方法三磷酸腺苷生物发光法”。但是，这种方法还没有被应用于中药饮片及中间品的微生物快速检测。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于ATP生物发光的中药材中微生物总量快速检测方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于ATP生物发光的中药材中微生物总量快速检测方法，包括如下步骤：

(1)将待测中药材的校正集样品加入至缓冲液中，震摇、稀释后得到供试液，将供试液加入培养基中进行培养，然后计算供试液的微生物总量；

(2)将所述的步骤(1)中的供试液进行预增菌处理后，将菌液、助剂与荧光素酶制剂混合均匀后检测相对发光强度；

(3)以平均相对发光强度值或平均相对发光强度值的对数值(至少平行测定三次后求平均值)为纵坐标，以所述的步骤(1)中得到的微生物总量的对数值为横坐标，绘制微生物含量分布图；

(4)以2020版中国药典《1107非无菌药品微生物限度标准》规定的微生物限度为10-10⁶CFU/g(或CFU/mL)划定纵向合格限，以误判率划定预警限；