[发明专利]一种高产β-榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种高产β‑榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法。首先，通过germacreneA合成酶的筛选和甲羟戊酸代谢途径的过表达实现β‑榄香烯和germacreneA的从头合成；然后，通过删除中心碳途径中的竞争途径确保了类异戊二烯途径中乙酰辅酶A、丙酮酸和甘油醛‑3‑磷酸的可用性；接着采用番茄红素颜色作为高通量筛选方法，通过易于出错的PCR诱变获得了优化的NSY305N。最后，在摇瓶中，通过关键途径酶、外排工程和翻译工程的最终构建的菌株β‑EL‑4产生了1161.09mg/L的β‑榄香烯和852.36mg/L的germacreneA，是目前报道的摇瓶水平的最高产量，在4‑L补料分批发酵中，β‑榄香烯和germacreneA的产量分别达到3.52g/L和2.13g/L。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种高产β-榄香烯和germacre ne A的重组菌的构建方法。

背景技术

β-榄香烯是一种天然存在的倍半萜，主要通过从姜黄属植物中分离产生，是治疗各种癌症肿瘤的最广普的抗肿瘤药物之一，具有很广阔的应用前景和市场需求，而目前从姜科植物温郁金中提取的产量远远无法满足工业需求。而化学合成的生产方法成本高、收率低、不可再生，因此，利用底盘微生物绿色制造生产β-榄香烯被寄予厚望。其生产效率涉及代谢途径的平衡表达、蛋白表达效率、关键酶的活性、副产物的积累、胞外运输等多种复杂的生理过程，解析这些生理过程对β-榄香烯的生物合成有何影响效果及其影响机制对构建高产倍半萜的底盘细胞具有重要作用。

据研究，β-榄香烯由germacrene A通过Cope-Claisen重排生成，虽然β-榄香烯已从姜黄属植物中提取，但其合成酶尚未被鉴定，因此生物研究使用ger macrene A合成酶用于合成β-榄香烯。最近在Nostoc sp PCC 7120中鉴定了一种催化FPP电离为germacrene A的I类非植物倍半萜合酶，已被引入酿酒酵母(S.cerevisiae)中，用于germacreneA的生物合成，在摇瓶中达到190.7mg/L和309.8mg/L的产量；Chen et al.和Li et al.最近通过在大肠杆菌中表达germ acrene A合成酶，分别实现了126.4mg/L和364.26mg/Lβ-榄香烯的产量。

类异戊二烯的生物合成效率涉及多种复杂的生理过程，如代谢途径的平衡表达、途径前体的积累(代谢工程)、蛋白质表达效率(翻译工程)、关键酶的活性(蛋白质工程)和细胞外转运(外排工程)。

故，了解β-榄香烯生物合成的作用及其机制对于构建底盘至关重要。β-榄香烯的微生物生物合成取决于细胞内前体法尼烯基焦磷酸(FPP)的可用性，该前体来源于两种通用类异戊二烯前体异戊烯基焦磷酸盐(IPP)和异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的缩合。两个主要途径是IPP和DMAPP的供应，包括甲戊酸盐(MVA)途径和2-甲基-D-红细胞醇4-磷酸(MEP)途径。其中，外源MVA途径已被引入大肠杆菌中，以有效产生类异戊二烯。除了M VA途径的代谢工程外，改写天然中心碳代谢也是有效利用节点衍生分子的重要策略。

本发明提供了在类异戊二烯生产和高效细胞工厂建设中成功协调使用代谢工程、转录工程、外排工程和蛋白质工程的实例，以生产最高水平的倍半萜。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高产β-榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括，

选择β-榄香烯从头生物合成效率高的合成酶；