[发明专利]一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在枯草芽孢杆菌基因组nprE位点整合PmtlA启动子调控的编码转化转录因子comK的基因序列；消除抗性基因后，在aprE位点整合含有P43启动子调控的T7 RNA聚合酶基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164MCT；

2)在步骤1)获得的重组枯草芽孢杆菌BS164MCT基础上，在srfAA位点整合T7启动子控制的编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因片段；消除抗性基因后，在bacA位点整合T7启动子控制的编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶的基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164GF；

3)克隆来自于大肠埃希氏菌K-12或其衍生菌株的GDP-D-甘露糖水解酶基因或其突变体到表达载体pMK4，构建T7启动子控制的高效表达质粒pMK4-T7-WcaH；

4)将步骤3)构建得到的高效表达质粒pMK4-T7-WcaH转化步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF，获得一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164GF-pW；

5)在步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF基础上，在rocD位点整合T7启动子控制的编码GDP-D-甘露糖水解酶的基因片段，获得另一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164FU。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述编码转化转录因子的comk基因由甘露醇诱导启动子PmtlA控制，所述编码转化转录因子的comk基因是SEQ IDNO:1所示的序列，或者是与SEQ ID NO:1具有85％以上同源性且具有相同功能的序列；所述编码T7 RNA聚合酶的基因由T7启动子控制，所述编码T7 RNA聚合酶的基因是SEQ ID NO:2所示的序列，或者是与SEQ ID NO:2具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因是SEQ ID NO:3所示的序列，或者是与SEQ IDNO:3具有85％以上同源性且具有相同功能的序列；所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶的基因是SEQ ID NO:4所示的序列，或者是与SEQ IDNO:4具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高效表达质粒载体pMK4-T7-WcaH通过克隆一个来自于大肠埃希氏菌K-12或其衍生菌株的GDP-D-甘露糖水解酶的基因到表达载体pMK4获得，所述高效表达质粒载体pMK4-T7-WcaH的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，或者是与SEQ ID NO:5具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述编码GDP-D-甘露糖水解酶的基因是SEQ ID NO:6所示的序列，或者是与SEQ ID NO:6具有85％以上同源性且具有相同功能的序列。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌株为枯草芽孢杆菌ATCC6051a。