[发明专利]一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种生产L‑岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，包括重组枯草芽孢杆菌BS164GF‑pW、BS164FU；BS164GF‑pW通过克隆GDP‑D‑甘露糖水解酶基因构建载体pMK4‑T7‑WcaH转化重组枯草芽孢杆菌BS164GF获得，BS164FU通过在BS164GF上整合GDP‑D‑甘露糖水解酶基因获得；所述BS164GF通过在枯草芽孢杆菌基因组上依次整合comk基因、T7RNA聚合酶基因、T7‑manA‑manB‑manC基因、T7‑gmd‑wcaG基因获得。本发明通过构建重组枯草芽孢杆菌首次以GDP‑L‑岩藻糖为底物实现了L‑岩藻糖的从头合成，相比传统酸解法更加环保。

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

L-岩藻糖(6-脱氧-L-半乳糖)是一种广泛存在于植物、细菌和动物体内的单糖，在自然界中主要以多糖的形式存在。褐藻、海草和棘皮动物体内存在一类富含岩藻糖的硫酸盐碳水化合物，称为岩藻聚糖。L-岩藻糖是细菌胞外多糖(EPS)的主要成分，在哺乳动物细胞中存在许多N-和O-连接聚糖和糖脂的岩藻糖基末端修饰。岩藻糖和其他己糖之间的结构差异在于6位碳上缺少羟基。L-岩藻糖和含岩藻糖的分子，如岩藻糖基低聚糖和岩藻多糖，具有生物活性并发挥独特的生理功能。单糖岩藻糖可以作为细菌的能量来源、粘附位点或毒力因子。在人类宿主中，许多抗体是针对含岩藻糖的聚糖基序的，它可以影响免疫反应的结果，保护宿主免受感染和炎症。岩藻糖基低聚糖在已鉴定的母乳低聚糖(HMO)中所占比例最大，对婴儿的生长和健康至关重要。例如2’-岩藻糖基乳糖具有抑制病原菌、预防过敏性疾病、促进益生菌生长、促进婴儿免疫系统和大脑发育等生理功能。此外，岩藻多糖通过抑制病毒附着、进入和复制，对一系列呼吸道病毒具有抑制作用。

L-岩藻糖可通过酸解从褐藻中提取，或通过酶解富含岩藻糖的微生物胞外多糖提取，这些水解方法需要从糖混合物中纯化岩藻糖。一些异构己糖也可以通过化学方法转化为L-岩藻糖。然而，这些L-岩藻糖生产方法存在环境不友好或不经济的缺陷，同时限制了应用场景。因此，在经典的工程微生物中设计和构建人工合成途径，从可持续碳源中生产L-岩藻糖是一种高效且环保的方法。作为GRAS(Generally Regarded As Safe)菌种，枯草芽孢杆菌不产致热源、内毒素，无毒副作用，可以减轻后续的分离纯化成本，适合用来生产L-岩藻糖。目前还没有实现利用枯草芽孢杆菌进行L-岩藻糖从头合成的技术或报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用，从而解决现有技术中L-岩藻糖的生产方法存在经济效益低、环境不友好的问题。

为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：1)在枯草芽孢杆菌基因组nprE位点整合PmtlA启动子调控的编码转化转录因子comK的基因序列；消除抗性基因后，在aprE位点整合含有P43启动子调控的T7 RNA聚合酶基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164MCT；2)在步骤1)获得的重组枯草芽孢杆菌BS164MCT基础上，在srfAA位点整合T7启动子控制的编码果糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的基因片段；消除抗性基因后，在bacA位点整合T7启动子控制的编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶的基因片段，得到重组枯草芽孢杆菌BS164GF；3)克隆来自于大肠埃希氏菌K-12或其衍生菌株的GDP-D-甘露糖水解酶基因及其突变体到表达载体pMK4，构建T7启动子控制的高效表达质粒pMK4-T7-WcaH；4)将步骤3)构建得到的高效表达质粒pMK4-T7-WcaH转化步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF，获得一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164GF-pW；5)在步骤2)得到的重组枯草芽孢杆菌BS164GF基础上，在rocD位点整合T7启动子控制的编码GDP-D-甘露糖水解酶的基因片段，获得另一种生产L-岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌BS164FU。