[发明专利]一种参薯原生质体的制备方法与应用

说明书

本发明提供一种参薯原生质体的制备方法与应用，本发明包括以下步骤：取参薯组培苗嫩叶，并切成0.5‑1.0mm的条带；在切割过程中，将叶片放置在用甘露醇浸泡的滤纸上，并将叶片放入酶溶液中酶解3‑9h；所述酶溶液包括0.4‑1.2w/w％纤维素酶、0.5‑1.5w/w％离析酶、0.01～0.03w/w％果胶酶；用W5溶液洗涤，过滤，过滤时用W5溶液洗涤，过滤后，通过离心收集叶片释放的原生质体，并将其重新悬浮在W5溶液中。本发明可以获得更高的参薯原生质体产量，且原生质体活力达到92％以上。本发明可以高效的获得大量高活力的参薯原生质体，为蛋白质亚细胞定位以及基因功能分析提供良好的实验材料。

技术领域

本发明涉及原生质体制备技术领域，具体涉及一种参薯原生质体的制备方法与应用。

背景技术

原生质体是指去除细胞壁后的细胞，由于去除了细胞壁屏障，原生质体可以吸收微生物、核酸等大分子物质，这使其可作为受体构建基因瞬时表达系统，广泛用于蛋白质亚细胞定位、基因功能研究等。

从不同组织和植株分离的原生质体保留了原来的生理活性和调节功能，代谢方式和生理环境更接近细胞在整株植株上的状态，提供了比细菌、酵母菌、动物细胞更好的细胞体系用于植物研究，是蛋白亚细胞定位、基因功能验证等研究的良好材料。常用的受体细胞包括洋葱表皮细胞、拟南芥和烟草叶肉原生质体等，特别是洋葱表皮细胞大、无色素、容易观察与转化，很多基因的亚细胞定位都可以在洋葱中明确蛋白的表达。但是由于不同植物细胞本身存在的差异性，导致常用的原生质体细胞往往不能完全适用于所有的基因功能研究，例如由于洋葱表皮细胞缺少叶绿体，会使在叶绿体中起功能表达的基因错误的表达在细胞的其他位置，从而造成结果的假阳性。因此如果可以利用植物自体的原生质体来作为受体细胞，将大大增加研究的准确性。近年来很多植物原生质体都已获得，例如甘蓝、水稻、烟草、小麦、黑麦草等，同时在这些物种原生质体中定位基因产物、研究蛋白互作的瞬时表达系统也已建立并成熟。

参薯，Dioscorea alata Linn，薯蓣科薯蓣属多年生草本植物，又名大薯、脚板薯。目前，关于参薯原生质体的研究较少，鲜见关于参薯原生质体制备方法的相关报道。关于如何高效制备参薯原生质体的问题还有待进一步解决。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种参薯原生质体的制备方法与应用。

本发明技术方案如下：

一种参薯原生质体的制备方法，包括以下步骤：

(1)取参薯组培苗嫩叶，并切成0.5-1.0mm的条带；在切割过程中，将叶片放置在用甘露醇浸泡的滤纸上，并将叶片放入酶溶液中酶解3-9h；

所述酶溶液包括0.4-1.2w/w％纤维素酶、0.5-1.5w/w％离析酶、0.01～0.03w/w％果胶酶；

(2)用W5溶液洗涤，过滤，过滤时用W5溶液洗涤，过滤后，通过离心收集叶片释放的原生质体，并将其重新悬浮在W5溶液中；最后，将原生质体离心并重新悬浮在W5溶液中。

优选的，所述组培苗嫩叶为组培苗从顶部开始的第二和第三片叶子。

优选的，酶解时间为6-7h。

优选的，所述W5溶液包括154mM NaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl和2mM MES。

优选的，步骤(1)中，每10ml酶溶液放入0.9g-1g叶片。

优选的，所述酶溶液包括0.8w/w％纤维素酶R-10、1w/w％离析酶R-10、0.01w/w％果胶酶、0.1w/w％BSA、0.7mol/L甘露醇、20mM KCl、10mM CaCl₂、20mM MES。

优选的，所述酶溶液中还包括质量浓度0.2％～0.4％半胱氨酸和12～15mM EDTA。