[发明专利]一种转化合成酪醇的苯丙酮酸脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种转化合成酪醇的苯丙酮酸脱羧酶突变体及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了苯丙酮酸脱羧酶突变体ARO10supgt;D331S/supgt;、ARO10supgt;D331V/supgt;和ARO10supgt;D331C/supgt;，并采用E.coli YMGR作为宿主菌株，以pKK223‑3质粒为载体表达了酿酒酵母中苯丙酮酸脱羧酶突变体ARO10supgt;D331S/supgt;、ARO10supgt;D331V/supgt;和ARO10supgt;D331C/supgt;。该菌株在装有50mL M9Y培养基的250mL摇瓶中发酵，酪醇产量分别为1.91g/L、2.02g/L、2.04g/L，高于目前绝大多数研究团队的成果。

技术领域

本发明涉及一种转化合成酪醇的苯丙酮酸脱羧酶突变体及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

酪醇(tyrosol)是一种天然的单酚类化合物，在食品、化妆品、营养补充剂和医药行业中应用广泛。它是已知的最强天然抗氧化剂之一，例如抗氧化和抗癌，并且具有充当心脏和神经保护剂的潜力。因此，酪醇具有巨大的商业应用价值，而大规模生产酪醇成为一种必然的趋势。目前我国对酪醇的生产仍然处于天然提取和化学合成阶段。天然提取主要是从红景天苷、橄榄果、叶以及在橄榄油制备过程中产生的残渣和废水中进行，其优点是原始材料便宜且丰富，但缺点是使用强酸性水蒸汽，回收率低，且易产生二次污染。而化学合成使用的基质相对昂贵，并且这些过程通常需要保护和脱保护步骤，降低总收率；成本高、污染严重、安全性低，不能应用于食品及药品的添加。

目前已知的酪醇作用就有多种：(1)心血管药物美托洛尔、倍他洛克等的合成：对动脉硬化、高血压、心脏病、脑溢血等预防与治疗；(2)安全高效的抗氧剂：应用于美容产品保健品；(3)高效稳定的抗炎性：抑制过敏性炎症等疾病；(4)抗衰老、对骨骼系统有益处：有助于人体对矿物质的吸收，减少骨骼疏松；(5)提高内分泌系统功能，促进新陈代谢，促进伤口愈合，消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，延缓衰老；(6)抗癌防癌：促进癌症后期恢复和提高化疗效果。因此，大规模生产酪醇成为必然的一种趋势。

在现有报道当中，虽然已有安全高效的生物法合成酪醇，例如：通过在大肠杆菌中表达来自酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶ARO10生产酪醇(文章《High-level production oftyrosol with noninduced recombinant escherichia coli by metabolicengineering》)，产量有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高活性苯丙酮酸脱羧酶突变体以及安全高效、价格低廉的生物法合成酪醇的方法。

本发明提供了苯丙酮酸脱羧酶ARO10突变体，所述苯丙酮酸脱羧酶突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的亲本酶ARO10的基础上，进行了如下任一种突变：

(1)将第331位的天冬氨酸突变为丝氨酸，命名为ARO10^D331S；氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

(2)将第331位的天冬氨酸突变为缬氨酸，命名为ARO10^D331V；氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；

(3)将第331位的天冬氨酸突变为半胱氨酸，命名为ARO10^D331C；氨基酸序列如SEQID NO.3所示；

在一种实施方式中，所述亲本酶苯丙酮酸脱羧酶ARO10来源于酿酒酵母。

在一种实施方式中，编码所述苯丙酮酸脱羧酶ARO10的基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

本发明还提供了编码所述苯丙酮酸脱羧酶突变体ARO10 ^D331S、ARO10 ^D331V或ARO10^D331C的基因。