[发明专利]一种耐热性增强的葡萄糖异构酶及应用

权利要求书

1.一种耐热性增强的葡萄糖异构酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述耐热性增强的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用。

3.根据权利要求2所述耐热性增强的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：取D-葡萄糖母液，加入PB、纯水，加入权利要求1所述葡萄糖异构酶的粗酶液，80℃反应。

4.根据权利要求3所述耐热性增强的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：

(1)通过引物拼接的方法，将SEQ ID NO：1所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；

(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵

①摇瓶发酵

挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10mL高压灭菌后的培养基A中，30℃，250rpm过夜培养；

次日取1L三角瓶，按1：100的接种比实施例接入到100mL高压灭菌后的培养基B中，于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；

培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；同时取少量菌体进行SDS-PAGE检测；

②分批补料发酵

分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml种子摇瓶，当种子摇瓶的培养物为OD2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的pH值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当OD600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mM IPTG诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存。

5.根据权利要求4所述耐热性增强的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，所述培养基A为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。

6.根据权利要求4所述耐热性增强的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，所述培养基B为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。

7.根据权利要求4所述耐热性增强的葡萄糖异构酶在催化D-葡萄糖生成D-果糖中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，葡萄糖0.4％，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。