[发明专利]分离凝血因子VIII配合物的方法

说明书

本发明涉及利用凝胶过滤作为第一分离步骤从体液如血浆中分离生物学化合物如蛋白质，特别是凝血因子Ⅷ的方法。

凝血因子Ⅷ又称为抗血友病因子A或AHF，是一种参与血凝的固有途径的血浆蛋白。

凝血因子Ⅷ以极低的浓度在血浆中循环，其存在形式为分别具有凝血因子Ⅷ凝血活性(凝血因子Ⅷ:C)和利托菌素辅因子活性(von Willebrand因子(VWF))的两种蛋白质的非共价配合物，所述的配合物分子量为1-20×10⁶D。

凝血因子Ⅷ:C在患有出血性疾病-血友病A的个体中100,000人约有5人没有或缺乏。

von Willebrand因子与活化血小板的结合方式可增强活化血小板的聚集。这一作用可在体外通过利托菌素诱导的血小板的聚集来检测。由于von Willebrand因子生物学活性的缺乏或降低，可与von Willebrands病一道看到出血时间延长。

对于患有血友病A的血友病者和患有von Willebrands病严重病症的患者，现在采用含有凝血因子Ⅷ:C/VWF的浓缩物进行治疗，这种疗法大大改善了患者的生命力和经济上的接受力并有助于延长这些患者的寿命。

可由血液或血浆生产含有凝血因子Ⅷ(凝血因子Ⅷ:C和/或VWF)的药物组合物。可用各种不同的已知方法来生产这样的制剂，所有已知方法的特征在于凝血因子Ⅷ:C的产率尤为低。几乎所有方法的共同之处是最初的纯化步骤包括低温沉淀。通过低温沉淀，冷冻的血浆在0-4℃下融化，结果产生含有凝血因子Ⅷ的沉淀物，可通过例如离心进行收集。尽管低温沉淀是相对简单的，但它有一个主要的缺点，即当大规模使用时，如使用5kg以上的血浆库，凝血因子Ⅷ:C的产率低(30-45％的血浆含量)，这意味着不论在后面采用哪种纯化步骤，最终产率都低。

此外，一般说来在生产凝血因子Ⅷ制剂过程中包括病毒失活步骤。病毒失活步骤大大增加了抗制剂中病毒的安全性，但在多数情况下会导致凝血因子Ⅷ:C产率的进一步降低。

凝血因子Ⅷ的总产率极低造成了这些制剂在某些地区短缺，因此需要新的以高产率纯化凝血因子Ⅷ的方法以满足用凝血因子Ⅷ治疗血友病者的要求。

以高产率直接从血浆中分离凝血因子Ⅷ的新方法意义非常重要，因为使用低温沉淀法或使用该法之前，血浆中凝血因子Ⅷ含量的损失高达70％。

最近尝试了用亲合色谱法直接从血浆中分离凝血因子Ⅷ(Thromb.Haemost.,61,(2),234-237(1989))，但所分离出的含凝血因子Ⅷ的部分其产率仅为低于60％，其比活性为1IU凝血因子Ⅷ/mg蛋白。

凝胶过滤又称为凝胶渗透色谱或颗粒排阻色谱，是一种扩散控制方法，用于按大小分离溶质。使溶质通过一填充有惰性多孔凝胶颗粒的柱，颗粒的孔径可排阻最大的分子，而较小的分子可扩散到凝胶颗粒内部的静止相中。因此，完全从凝胶颗粒中排除的最大的分子先随着“外水体积”洗脱出来，而较小的分子流经柱的时间较长，按渐减的大小随着渐增的“流出体积”洗脱出来。

凝胶过滤可以两种不同的方式进行：

1．组分离方式

在组分离方式中，将溶质分成其分子大小大不相同的两组，一组随着外水体积洗脱出来，另一组随后洗脱出来，其流出体积要大得多，常常接近于总的“柱床体积”；这一方法主要用于从溶解的盐中分离蛋白质或用于交换缓冲液，被称为“脱盐”。对于“脱盐”，可使用小孔径的刚性凝胶并可使用大量物料(样品体积占20-30％的柱床体积)和采用高流速(每小时约1柱床体积的缓冲液)实现本方法；因此，柱容量大。

2．分级分离方式

在分级分离方式中，分离分子量相似的溶质；这一方法常用于分离蛋白质。为此，应使用较大孔径的凝胶颗粒且选择的凝胶过滤介质应保证在相对于总柱床体积的外水体积和流出体积之间洗脱出蛋白质。与采用组分离条件相比，洗脱出的物质更接近，并可重叠。此外，高流速是不适宜的，因为这样不能有效地分离蛋白质，并且必须保持低的柱负荷以获得各蛋白质的合理分离。因此，以分级分离方式进行的凝胶过滤只适于作为蛋白质分离的最后的精制步骤。其中待分级分离的体积较小(Jagschies,UllmannsEncyclopedia of Industrial Chemistry,vol.B3(10),1988 and Bio/Technol.,4,954-58(1986))。