[发明专利]新型葡激酶及其生产方法

说明书

本发明涉及一种生物工程的溶栓药物及其生产方法，特别涉及一种新型葡激酶及其生产方法。

葡激酶能与纤维蛋白溶酶原结合形成复合物，使其活化为纤维蛋白酶，并特异性地降解纤维蛋白，使血栓溶解，从而使其成为一类新的有发展前景的溶栓药物。目前，已有的葡激酶的基因是日本的学者Sako等从金黄色葡萄球菌的Sφ-c噬菌体中分离得到的(T.Sako et al. Cloning and Expression of theStaphylokinase Gene of Staphylococcus aureus in Escherichia coli：Mol Gen Gene(1983)190：271.)。从噬菌体中分离基因，需要将溶源性菌株培养至裂解状态，进行噬菌体的分离，再从噬菌体中分离所需要的基因片段，步骤较多，操作较复杂，并且只限于这一种葡激酶的基因来源，还不能满足对葡激酶的溶栓机理和临床应用进行全面、深入研究的需要。

本发明的目的在于寻找含有葡激酶基因的新的来源，简化操作步骤，提高效率，并获得新型结构的葡激酶。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

利用PCR扩增技术，以含葡激酶基因的金黄色葡萄球菌溶源性菌株的染色体DNA为模板，设计合适的引物序列，进行扩增反应，从而获得编码新型葡激酶的DNA序列，该DNA编码序列与现有技术所得到的葡激酶DNA编码序列比较，第109位的核苷酸发生了变异，本发明实施例所涉及的DNA编码序列的第109位的核苷酸变异为鸟苷酸；通过基因工程的方法，进行重组新型葡激酶DNA序列表达载体的构建；重组表达载体转化宿主细胞，得到工程菌株；工程菌株进行培养表达；表达产物进行分离纯化、氨基酸序列的分析及生物活性的测定，所得到的新型葡激酶的氨基酸序列与现有技术所得到的葡激酶的氨基酸序列比较，第37位的氨基酸发生了变异，本发明实施例所涉及的新型葡激酶的氨基酸序列的第37位氨基酸变异为甘氨酸。

由于本发明通过PCR技术扩增金黄色葡萄球菌溶源性菌株染色体DNA中的新型葡激酶的基因片段，比现有技术操作步骤简单，提高了重组基因产物的生产效率，产物表达水平和生物活性均高于文献报导，这为葡激酶溶栓机理和临床应用的深入研究提供了新的物质来源。

附图说明：

图1为本发明新型葡激酶的DNA编码序列。

图2为本发明新型葡激酶的氨基酸序列。

以下为本发明的实施例。

一、含有新型葡激酶基因的金黄色葡萄球菌溶源性菌株染色体DNA的提取

将金黄色葡萄球菌FRI610A溶原菌(由本院雷祚荣教授提供)接种于培养基中，经37℃培养，4℃离心收集菌体，用TE洗涤菌体后再以TE悬浮菌体，加入ProteinaseK混匀后，加入10％的SDS，37℃培养1小时，然后加入等体积的酚，颠倒混匀一分钟，离心，取上相，再用酚和酚/氯仿各抽提一次，加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水乙醇，置-20℃2小时，4℃离心，沉淀DNA，将沉淀的DNA用75％的乙醇洗涤，最后将沉淀溶于无菌双蒸水中，-20℃保存备用。

二、PCR扩增葡激酶基因

1.引物的设计

上游引物：GGAATTCAAATGTCAAGTTCATTCGACAAAGGA

下游引物：CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAACAAC

在两引物的5′端分别引入Eco RI和Bam HI的内切酶识别位点。以步骤一所得到的染色体DNA为模板，加入适量的引物，进行PCR扩增反应，反应的条件为：94℃1分钟→50℃1分钟→71℃1分钟，30个循环，最后一个循环的72℃延伸5分钟。反应物进行电泳分析，结果表明，在大小与葡激酶基因相符的位置上，有十分特异的DNA条带，将PCR反应物纯化后，溶于无菌双蒸水中，-20℃保存备用。

三、PCR反应物的DNA序列分析

用Eco RI和Bam HI消化载体pUC18，电泳回收载体；再以Eco RI和Bam HI消化步骤二所得到的葡激酶基因片段，电泳回收消化的基因片段。将回收的载体和基因片段按比例混合，用T₄DNA连接酶进行连接，然后将连接产物转化至EcoliJM101受体菌内，经筛选得到重组克隆，大量抽提重组克隆的质粒DNA，进行DNA编码序列的分析，结果见图1。

四、目的基因的克隆表达

将所得到的葡激酶基因用内切酶Eco RI和Bam HI进行消化，与用同样的内切酶消化的载体pBV220进行混合，加入T₄DNA连接酶，14℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌EcoliHB101中，挑取转化子接种培养，提取质粒DNA，以Eco RI和Bam HI双酶切质粒，经筛选，获得阳性重组子，将重组子接种于M9CA培养基中，培养一定时间后，进行42℃诱导表达，培养结束后，收集菌体，进行SDS-PAGE分析，结果表明，在分子量大小与葡激酶相符的位置上，有一条较深的带，其表达水平为表达量占菌体总蛋白的70％。表达产物经纯化后，以链激酶为标准蛋白，进行溶圈法生物活性的测定，比活性为3×10⁶U/mg，说明本发明所得到的新型葡激酶具有潜在的溶解血栓的药物用途。纯化产物经氨基酸序列分析，其结构如图2所示。