[发明专利]甲胎蛋白基因表达的调控序列及其应用

说明书

DNA是生物遗传信息的携带者，DNA上面有成千上万个基因，这些基因决定着生物的各种具体形状特征。从DNA和蛋白质的分子水平上说，基因表达包括了基因转录、转录产物的加工、转录物mRNA转译为蛋白质和蛋白质转译后加工等主要过程。这些过程调节与控制着生物的发育、代谢、分化、反应性、老化和病变等生命现象。因此，对基因表达调节控制的研究，在理论上可以阐明各种生命现象的过程和机制，在实践上可以应用于改良生物品种、研制基因工程产物和利用基因治疗技术治疗人类疾病。

癌症是危害人类健康与生命的最严重疾病之一。其中，肝癌又是死亡率最高的一种癌症。尤其是中晚期肝癌患者，失去手术切除病灶的可能，基本上处于等待死亡的状况。研究表明，用基因治疗技术可以杀伤肝癌细胞，从而缓解肝癌症状并延长患者生命。但是，如何在基因治疗过程中只是专一地杀伤肝癌细胞，提高治疗效果；而不损害正常的肝脏细胞，避免毒副作用，也就是说，使治疗基因有控制地表达，是基因治疗中必须解决的一个普遍性难题。本发明将基因表达调节控制这个生命科学的理论研究课题与肝癌的基因治疗这个应用研究问题相结合，设计并构建了一个能使治疗基因在肝癌细胞中专一表达的DNA元件。

本发明的原理在于：甲胎蛋白(AFP)是一个在哺乳动物胚胎发育过程中受到严格调节控制的蛋白质。它是胎儿的主要血浆蛋白，出生后则逐渐减少。但是，患肝癌时，癌细胞中afp基因又高度表达。所以，有70～98％肝癌患者是AFP阳性的。这说明，肝癌细胞中有调节控制afp基因表达的机制存在。因此，AFP成为诊断肝癌的一个重要指标。

同时，这也提示，利用afp基因调控机制就有可能使治疗基因专一地在肝癌细胞中表达，产生出杀伤癌细胞的基因产物，而对正常细胞不会有毒害作用。有研究表明[Wen,P.et al1991,1993；Groupp,E.R.et al.,1994]，甲胎蛋白基因的表达除受到基因表达调节元件启动子和增强子的控制外，还受到沉默子的调节。沉默子位于启动子与增强子之间，当基因表达调节蛋白与沉默子结合时，就阻碍了转录因子与启动子和增强子的相互作用，而阻抑基因表达。所以，沉默子是afp基因的一个负调节元件，它在甲胎蛋白基因的发育性阻抑中起重要作用，而在AFP阳性的肝癌细胞中不起作用。如果把治疗基因置于这个元件的调控之下，就有可能使治疗基因只在AFP阳性的肝癌细胞中表达，产生对细胞有毒性的基因产物，杀伤肿瘤细胞，而不会影响正常细胞。但是，具有肝癌专一性的AFP基因上游调控序列太长，约有7kb，而目前许多基因表达载体包括在基因治疗中广泛使用的病毒载体(如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等)无法容纳7kb的基因调控序列，因此，AFP基因调控序列的应用受到了一定的限制。

根据已发表的7kb大鼠AFP基因表达调控序列[Buzard,G.et al.,1990]，我们用聚合酶链反应(PCR)技术从SD大鼠肝中克隆了含启动子、沉默子的片段rAFP(-911bp/+1bp)，从人肝癌组织基因组DNA中克隆了具有肝专一活性的α1-AT(胰蛋白酶抑制剂)基因的增强子AT(-755bp/-37bp)。经DNA序列测定证明无误后，将这两个片段连成一个1.7kb的基因表达调控序列ATrAFP，置于CAT报告基因之前，装入质粒pBluescript，形成哺乳动物细胞表达质粒ATrAFP-pCAT。将ATrAFP-pCAT分别转入人非肝细胞Hela、原代培养人成纤维细胞、人肝细胞株L-02、原代培养肝细胞、AFP阴性人肝癌细胞株SMMC7721、AFP阳性人肝癌细胞株HepG2及AFP阳性原代培养人肝癌细胞LTNM4，经CAT分析，CAT报告基因仅在AFP阳性人肝癌细胞株HepG2及AFP阳性原代培养人肝癌细胞LTNM4中获得较高水平的表达，而在其他细胞中均不表达。

实验结果表明：本发明构建的1.7kb基因表达调控序列ATrAFP(见图1)的专一性很好，只在AFP阳性人肝癌细胞中具有较高的活性，而在非肝正常细胞、正常肝细胞、AFP阴性肝癌细胞中均无活性。由于70％原发性肝癌病人的AFP水平明显升高，因此，ATrAFP可望用于这部分肝癌病人的基因治疗，以期获得治疗基因在肝癌细胞中的专一性表达。提高对肝癌细胞杀伤的针对性，尽可能降低对正常细胞尤其是肝细胞的毒副作用。

综上所述，本发明构建的ATrAFP基因表达调控序列具有以下特点：