[发明专利]麦芽α淀粉酶变体

权利要求书

1、一种生产亲本麦芽α淀粉酶之变体的方法，所述方法包括：

a)在附录中所述的SEQ ID NO：1的三维结构的基础上制作亲本α淀粉酶的模型以得到所述亲本α淀粉酶的三维结构；

b)鉴定步骤(a)中得到的三维结构中所述亲本的至少一个结构部分，其中预期所述结构部分的改变将产生所述改变的性质；

c)修饰编码亲本α淀粉酶的核酸序列以便在对应于所述结构部分的位置上产生编码一个或多个氨基酸缺失、插入或取代的核酸；和

d)在宿主细胞中表达所述修饰的核酸以产生变体α淀粉酶，

其中所述变体具有α淀粉酶活性并与亲本相比具有至少一种改变的性质。

2、权利要求1的方法，其中所述改变的性质是pH依赖活性、热稳定性、底物裂解模式、裂解比活性、转糖基作用、降低淀粉退化的能力、减少面包变质的能力、底物特异性、底物结合或钙结合。

3、一种构建亲本麦芽α淀粉酶之变体的方法，所述方法包括：

a)鉴定所述亲本麦芽α淀粉酶的三维结构中距该淀粉酶活性位点残基15埃内，特别是10埃内，并且涉及与活性位点残基的静电或疏水作用的氨基酸残基；

b)用改变活性位点残基的静电和／或疏水环境并且可以容纳在所述结构中的另一氨基酸残基取代所述氨基酸残基；

c)任选地循环重复步骤a)和步骤b)；

d)任选地，在一个或多个位置处进行不同于b)的氨基酸残基的插入、缺失或取代的改变，

e)制备从步骤a)-d)产生的变体；

f)检测所述变体的pH依赖活性；和

g)任选地循环重复步骤a)-f)；和

h)选择与亲本淀粉酶相比具有改变的pH依赖活性的变体。

4、一种构建亲本麦芽α淀粉酶之变体的方法，所述方法包括：

a)鉴定所述亲本的三维结构中的内腔或裂隙；

b)用提高疏水作用和／或填充或减小腔或裂隙的尺寸的另一氨基酸残基取代在所述腔或裂隙附近的氨基酸残基；

c)任选地循环重复步骤a)和步骤b)；

d)任选地，在一个或多个位置处进行不同于b)的氨基酸残基的插入、缺失或取代的改变，

e)制备从步骤a)-d)产生的变体；

f)检测所述变体的热稳定性；和

g)任选地循环重复步骤a)-f)；和

h)选择与亲本淀粉酶相比具有提高的热稳定性的变体。

5、权利要求4的方法，其中所述氨基酸残基的取代导致疏水作用的提高，用脯氨酸取代，用另一氨基酸取代组氨酸，钙结合的稳定，结构域间二硫键的导入，脱酰胺位点的除去，改变氢键接触，用带有较庞大侧基的氨基酸填充内结构腔，结构域间相互作用的导入，改变电荷分布，螺旋加帽或盐桥的导入。

6、一种构建亲本麦芽α淀粉酶之变体的方法，所述方法包括：

a)鉴定所述淀粉酶三维结构中距钙结合位点10埃内的氨基酸残基；

b)用另一氨基酸残基取代所述氨基酸残基以便提高与钙离子的作用；

c)任选地循环重复步骤a)和步骤b)；

d)任选地，在一个或多个位置进行不同于b)的氨基酸残基的插入、缺失或取代的改变，

e)制备从步骤a)-d)产生的变体；

f)检测所述变体的热稳定性；和

g)任选地循环重复步骤a)-f)；和

h)选择与亲本淀粉酶相比具有提高的热稳定性的变体。

7、一种构建亲本麦芽α淀粉酶之变体的方法，所述方法包括：

a)鉴定所述亲本淀粉酶三维结构模型中的底物结合区；

b)通过氨基酸取代、缺失或插入来修饰所述底物结合区；

c)任选地循环重复步骤b)；

d)任选地，在一个或多个位置进行不同于b)的氨基酸残基的插入、缺失或取代的改变，

e)制备从步骤a)-d)产生的变体；

f)检测所述变体的底物裂解模式；和

g)任选地循环重复步骤a)-f)；和

h)选择与亲本淀粉酶相比具有改变的底物裂解模式的变体。