[发明专利]抗腹泻的口服疫苗

说明书

本发明涉及一种抗腹泻口服疫苗。更淮确地说，是涉及一种抑制引起人腹泻的肠产毒性大肠杆菌的口服疫苗组合物。

背景

细菌和病毒通常在其膜上或膜内表达，特定环境中的蛋白质起到载体的作用，使生物体以特定方式联系或依附表面。这种表面可以是人或动物体的胃肠道的内壁、食道、或任何其它生物表面或者膜，生物体在这些地方可找到最适宜的生长环境。通常称这种微生物膜蛋白为移生因子抗原(CFA)或菌毛。文献中，这种物质也用其它词例如伞毛蛋白、血凝素蛋白、丝状蛋白或纤维蛋白表示。为方便起见，本文中用的“CFA”包括所有这类也可具有抗原特性的膜蛋白。对于大多数生物体，其CFA的产生受到环境中的各种因素控制，而它们也可以激活质粒DNA中的调节基因。

许多与医学有关的细菌已被证实可产生与其膜相关的CFA。在这些细菌中，对于人来说最重要的是定居在人的胃肠道和呼吸道的生物体。定居在胃肠道的生物体例如有肠产毒性大肠杆菌、霍乱弧菌、弯曲菌属、幽门螺旋菌、志贺菌属、沙门菌属和耶尔森菌属。

其中医学上特别有用的是肠产毒性大肠杆菌(ETEC)，因为它是旅行者腹泻和发展中国家儿童腹泻的一个主要诱因，每年多于十亿人出现腹泻且至少有一百万人死亡，主要是儿童。

肠产毒性大肠杆菌的特性是可产生热不稳定性肠毒素(LT)和/或热稳定性肠毒素(ST)。

在WO 92/14487中，公开了口服ETEC疫苗的制备方法和用途。带有CFA的ETEC细菌及其亚成分(CS-抗原)在特定条件下生长。然后可将随后被福尔马林杀死的细菌作为一种抑制ETEC细菌的口服疫苗。因此CFA和CS抗原在肠道发生的免疫过程中起到抗原的作用。

要有规模地生产带有CFA的ETEC细菌目前还存在困难，此问题在国际专利申请WO 95/33825中公开了一种解决方案。

ETEC疫苗的制剂包含B亚基霍乱毒素，它在抗原上与ETEC的热不稳定性肠毒素相似，还包含ETEC的移生因子抗原，已经证实这种疫苗制剂可刺激瑞典志愿者的相关粘膜的免疫应答(Jerborn M.，等，《疫苗》1997；16：255-260)。

为了产品安全且有效，疫苗组合物必须是非感染性的、且含有确定量的每批都相同的活性成分。

发明的说明

本发明提供了一种新的疫苗组合物，它基于阴性LT致死肠产毒性大肠杆菌，含有确定量的至少三种不同类型的移生因子抗原，和在抗原上与ETEC的热不稳定性肠毒素相似的B亚基霍乱毒素(CTB)。而且，该疫苗组合物是从可能存在的热稳定性肠毒素(ST)中纯化的。

LT阴性的ETEC细菌可以在实验室从天然基因修饰菌株中选择或通过重组技术制备。

可能存在的热稳定性肠毒素是19个氨基酸残基的一种较小的蛋白质，在疫苗组合物的下游处理过程中被中洗掉了。

消除细菌产生热不稳定性肠毒素的可能性和去除可能存在的热稳定性肠毒素可使产品安全。

杀死细菌应该以基本上保留移生因子抗原的方法进行，例如用温和的福尔马林失活的方法。

因此，本发明提供了一种抗引起人腹泻的肠产毒性大肠杆菌的口服疫苗组合物，它含有确定量的至少三种不同类型的移生因子抗原(CFAs)，该抗原选自CFA I、CFA II(CS1、CS2和CS3)和CFA IV(CS4、CS5和CS6)，与确定量的B亚基霍乱毒素(CTB)一起存在于缺乏编码热不稳定性肠毒素(LT^-)基因的死大肠杆菌中，还含有一种载体，该疫苗组合物是从可能存在的热稳定性肠毒素(ST)中纯化的。

在本发明口服疫苗的一个实施方式中，确定量的不同类型的CFA是指每一类型至少100μg，确定量的CTB是至少0.5mg，载体为生理学上可接受的缓冲溶液。

在一个优选实施方式中，确定量的不同类型CFA是指每一类型CFA为100-300μg，CTB的确定量为0.5-2.0mg。

在本发明的最优选的实施方式中，确定量的不同类型CFA是指200μg CFA/I、200μg CS1、150μg CS2、200μg CS4和CS5 150μg CS5，以及CTB为1.0mg，生理学上可接受的缓中溶液是磷酸缓中盐水溶液。

本发明疫苗组合物的剂量包含约10¹¹细菌。

该疫苗组合物以溶解在一杯水中的口服形式对人给药，水中含有碳酸盐缓冲剂，例如碳酸氢钠。实验不同移生因子抗原用量的确定