[发明专利]一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，首先在植物培养基上加入蔗糖和琼脂制成培养基，将栝楼种子接种在培养基上，将发根农杆菌接种在培养基上，使细菌活化，将栝楼种子的无菌植株作成外殖体，接种针刺伤沾菌的节位处，从节位处形成不定根，将其接种在营养液中得到毛状根，经纯化处理即获得核酸抑制蛋白。本发明的方法培养毛状根，其产量可以达到200-300g/L/20日，其中核酸抑制蛋白含量达到0.5-1.0‰。

主权项

1、一种栝楼毛状根诱导和培养生产核酸抑制蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下各步骤：(1)在每升MS植物培养基上加入20g/l蔗糖和8g/l琼脂，在125℃，0.1mPa压力下消毒15-18分钟，经冷却后作成平板培养基；(2)将栝楼种子用乙醇和次氯酸钠消毒后，接种在第1步的培养基上，于20-25℃，用日光灯照射，亮度为1000-3000lx，每日光照12-16小时培养20-30天，种子萌芽长成无菌植株备用；(3)在每升LB细菌培养基上加入10g/l琼脂，经125℃，0.1mPa压力下消毒15-18分钟，经冷却后作成斜面培养基；(4)将发根农杆菌LBA9402菌接种在第3步的培养基上，在35-37℃，避光条件下培养3天，将细菌活化；(5)将第2步培养出的无菌植株，从每个节间留下2枚叶片剪断，作成外殖体，并且在节位处涂上LBA9402细菌，用接种针刺伤沾菌的节位处，然后接种在第1步的培养基上，在20-25℃，日光灯下，强度为500-1000lx，培养10-30天，从被刺伤的节位处形成不定根；(6)在每升MS植物培养基上加入蔗糖20g/l和氨卞青霉素30-150mg/l制成杀菌培养基，将第5步形成的不定根剪下，放在杀菌培养基内，培养3-10天，更换同样的杀菌培养基内反复除菌培养2-5次，彻底除掉细菌后，转接在第1步的培养基内筛选生长速度最快的根系；(7)在每升MS植物培养基中加入20g/l蔗糖，制成培养液，加入筛选出的毛状根，在20-25℃，日光灯照射，光强为500-1500lx，在转速为90-150rmp的摇床上，培养15-25天，获得50-100倍重量的毛状根；(8)在生物反应器内，加入第7步的培养液，再添加维生素、氨基酸、诱导子，经高温灭菌处理后，按照培养液重量的2-10％接种上第8步的毛状根，在20-25℃，弱光或黑暗条件下培养15-30天，就会获得50-100倍重量的毛状根；(9)将毛状根经冷冻后进行破碎处理，然后在4℃低温下提取和分离蛋白质，经过纯化处理即获得26kd、27kd和29kd的核酸抑制蛋白。