[发明专利]一种在玻片上检测基因突变的方法

摘要

本发明公开了一种在玻片上检测基因突变的方法,其特征在于将杂交生成的完整异源DNA双链固定在玻片上,异源DNA双链中一条链的5′端与巯基硅烷化的玻片相交联,双链的5′端携带生物素,用羟胺溶液修饰错配碱基中的胞嘧啶,用高锰酸钾和氯化四乙胺混合液修饰错配碱基中的胞嘧啶,用哌啶剪切点突变中的被修饰嘧啶类碱基,加入2到5个单位的S1酸酶消化处理异源DNA双链,连人大肠杆菌碱性磷酸酶进行突变检测。本发明不仅能够在玻片上准确、灵敏、快速的检测结核杆菌耐药性基因点突变,而且检测DNA序列长度范围大,成本低廉,操作简便。

主权项

1、一种在玻片上检测基因点突变的方法，包括下列步骤：A、生物素标记检测的基因序列，将5′端带有巯基的引物分别扩增结核杆菌标准菌株中的基因片段，用5′端带有生物素标记的引物扩增突变型耐药性菌株的基因片段；B、异源DNA双链的获得，将纯化所得两种PCR产物在退火缓冲液中95℃变性，退火至25℃，无水乙醇沉降并回收；C、异源DNA双链在玻片上的固定，将纯化的双链DNA固定在经过硅烷化的玻片上，加入1-2μl的大肠杆菌碱性磷酸酶使其结合在异源DNA双链上，加入3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑蓝混合液，37℃反应30-60分钟；D、羟胺盐酸对固定的异源DNA双链中错配的嘧啶碱基的修饰，在固定异源DNA双链的玻片上加入20μl的2-4mM羟胺盐酸盐溶液PH6．0，37℃保温2小时，用终止缓冲液终止反应，用双蒸水清洗玻片，风干；E、高锰酸钾、氯化四乙胺混合液对异源DNA双链错配的嘧啶碱基修饰，在羟胺盐酸处理过的玻片上加入20μl的1-3mM高锰酸钾，20-30mM氯化四乙胺混合溶液，25℃保温1小时，用双蒸水清洗玻片，风干；F、用哌啶和S1核酸酶切割异源DNA双链，在风干的玻片上加入20-50μl，1-2M哌啶，90℃保温，用双蒸水清洗，风干，加入20μl含有2-5个单位的S1核酸酶，23℃保温；G、信号标记检测，清洗玻片，加入1-2μl的大肠杆菌碱性磷酸酶和3-5μl的5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸和硝基四氮唑蓝底物混合液，37℃反应30-60分钟。