[发明专利]红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法

摘要

本发明涉及红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法。红豆杉的外植体经诱导得到愈伤组织，初步筛选后利用单细胞克隆方法获得克隆细胞，再根据红豆杉细胞培养物的外观特征与细胞中紫杉醇含量的相关性进行筛选，最后对选到的细胞株进行含量测定和稳定性试验，获得生长速率为0.52g(dw)/L.d、紫杉醇含量为0.1％的细胞优株，紫杉醇含量较原植物提高了10倍。本发明具有简便、快捷选取紫杉醇高产细胞株的特点，能节省大量人力、物力、提高劳动生产率。

主权项

1.一种红豆杉细胞培养中筛选紫杉醇高产细胞株的方法，其特征在于：(1)红豆杉外植体用自来水洗净后，用酒精和次氯酸钠消毒，然后用蒸馏水清洗并截短至1～2厘米长，在其上划有伤痕后接种到固体培养基中培养2～5周诱导获得愈伤组织，愈伤组织在固体培养基上每20～25天继代一次，继代时，比较培养物的颜色、形态、含水量，选择生长快、颜色浅、颗粒明显的均匀细胞小粒进行继代培养，并进行紫杉醇的定量分析，从中选出含量高的继续培养；(2)经初步筛选获得的愈伤组织转移到液体培养基中进行悬浮培养，每10天继代一次。待第3代培养3～15天后，取出静置片刻，在无菌条件下将上层含有单细胞或小细胞团的培养液用吸管吸取，过150～250目筛，滤液为单细胞或有少数小细胞团的悬液，然后对单细胞进行看护培养；(3)看护培养是用经15～20天保温培养的同种红豆杉鲜细胞以5～10g(dw)/L的量接种到固体培养基上，上面铺滤纸，保温培养3～7天后将单细胞悬液以100～1000个/cm2的密度接种到滤纸上保温培养，以获得克隆细胞；(4)选取块状或颗粒较明显的克隆细胞，然后将选取的每一克隆细胞分为二部分，一部分每20～25天继代一次，另一部分培养22～27天后进行紫杉醇的定量分析，选出紫杉醇含量高的细胞株。