[发明专利]使用脱毒工程菌高密度发酵生产解毒酶的方法

摘要

本发明涉及的使用脱毒工程菌高密度发酵生产解毒酶的方法使用EscherichiacolipRL-B1脱毒工程菌，采用半合成或合成培养基，在搅拌式生物反应器内高密度发酵生产解毒酶，生产过程中，保持溶解氧浓度高于饱和浓度20％，流加氨水以补充氮源，流加葡萄糖为菌体生长提供碳源，保持葡萄糖浓度1.0g/L以下pH6.5～7.5，有生物活性的、可溶性解毒酶每升含量可达50毫克以上，解毒酶在细胞内形成的包涵体中解毒酶纯度超过80％，所生产的解毒酶，可用于降解被污染的水源、土壤，水果、蔬菜中的有机磷、有机氯、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯类杀虫剂，人、畜杀虫剂中毒的解毒治疗。

主权项

1.一种使用脱毒工程菌高密度发酵生产解毒酶的方法，其特征在于工艺步骤如下：1)制备脱毒工程菌种子液使用保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册编号为CGMCCNo.0290，名称为EscherichiacolipRL-B1的脱毒工程菌；取琼脂斜面上生长良好的上述脱毒工程菌，加入无菌水，制成细胞悬液，并将该细胞悬液以占液体种子发酵培养基体积1％～10％的接种量接种于液体种子发酵培养基中，在35～37℃范围内，180转/分的旋转摇床上培养12～16小时，制备脱毒工程菌种子液；所述的液体种子发酵培养基组份及配比为：每升液体种子发酵培养基中含：磷酸氢二钠2克，磷酸二氢钾4克，NaNO31.2克，硫酸镁0.1克，氯化钙0.05克，酵母膏2.0克，蛋白胨5.0克，pH值为7.0；2)分批补料高密度发酵生产解毒酶将上述脱毒工程菌种子液以占发酵培养基体积1～10％的接种量，接入发酵培养基中，进行发酵培养生产解毒酶，其发酵培养生产的条件为：发酵起始pH值为6.0～8.0，发酵搅拌转速200～800转/分，发酵温度15～42℃，发酵液与通气量的通气比为1∶1.0～2.0，发酵时间22～30小时，发酵过程中，随时监控发酵液的糖浓度、溶解氧浓度和pH值的变化，在糖浓度低于每升0.2克时，开始流加葡萄糖，以保证细胞生长和产物合成所需要的碳源和能源；在pH值低于7.0时，开始流加氨水，以保持发酵液pH值在7.0～7.5之间；所述的发酵培养基为半合成培养基或合成培养基，其半合成培养基的组成和配比为：每升半合成发酵培养基中含磷酸盐4.0～30.0克，硝酸盐1.0～5.0克，硫酸镁0.1～2.0克钙盐0.01～0.1克，酵母膏5.0～20.0克，蛋白胨5.0～20.0克，葡萄糖5.0～20.0克，消泡剂0.2～1.0毫升；其合成培养基的组成和配比为：每升合成发酵培养基中含磷酸盐4.0～30.0克，硝酸盐1.0～5.0克，硫酸镁0.1～2.0克，钙盐0.01～0.1克，EDTA0.001～0.02克，钴盐0.001～0.01克，铁盐0.05～0.5克，锰盐0.005～0.05克，铜盐0.001～0.01克，钼酸盐0.001～0.005克，锌盐0.001～0.005克，葡萄糖5.0～20.0克，消泡剂0.2～1.0毫升。