[发明专利]用PCR技术从人类全基因组Cosmid文库中筛选ApoAI可表达全基因的方法

摘要

本发明提供了一种用PCR技术从人类全基因组Cosmid库中筛选ApoAI可表达全基因的方法。本发明首次将PCR有效扩增ApoAI的部分序列作阳性指标，应用Pool Dilution方法从Cosmid库中筛选到的人ApoAI可表达全基因作ApoAI转基因动物。

主权项

1、一种用PCR技术从人类全基因组Cosmid文库中筛选ApoAI表达全基因 的方法，该方法是以PCR扩增部分片段作为阳性指标，逐级稀释人类全基 因组Cosmid文库的独立克隆数，从人类全基因组Cosmid文库中快速筛选包 含有该基因全部调控序列的全长为10.5Kb的ApoAI全基因的技术方法，该 方法由下列步骤组成： (1)人类全基因组Cosmid文库 从Clontech公司购买的人类全基因组Cosmid文库，DNA来源于32岁白 种人的胎盘，该文库使用的载体是pWE15，使用的宿主菌是大肠杆菌 NM538，该文库的独立克隆数为1.1×10⁶个/ml，滴度为10⁸个/ml，该文库 宿主菌中插入人类基因组片段长度为35-50kb，平均插入长度为38kb； (2)对人类全基因组Cosmid文库独立克隆的第一级稀释 (a)取10ul原始人类全基因组Cosmid文库的菌液，在100倍显微镜下， 使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数人类全基因组Cosmid 文库的菌液浓度为10⁸个/ml； (b)取上述10ul原始10⁸个/ml的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培 养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的浓度为10⁶个/ml； (c)取100ul步骤(2)(b)步骤获得的稀释菌液，加入1ml新鲜配置的 无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的浓度为10⁵个/ml； (d)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200ul新鲜配制的无 菌LB培养基，加入氨苄青霉素至终浓度为100ug/ml，另外每孔分别 加入(c)步骤得到的稀释菌液10ul，此时每孔中菌液的浓度为10³个 /ml，分布孔的范围为A1-H12； (e)将步骤(2)(d)步骤得到的细胞培养板放入37℃培养箱培养16hr， 此时每孔中菌液浓度为10⁸个/ml，独立克隆数为10³个/ml，每一个孔 内的菌液形成一个亚文库； (3)为PCR扩增人类ApoAI基因片段设计引物 根据GENEBANK号为gi：178765的人类ApoAI基因的序列，设计三对 引物，每一对引物的序列分别为： 第一对引物：可以扩增人类ApoAI基因部分起始序列，即人类ApoAI 基因-300bp到+50bp区域的片段，作为人类ApoAI基因起始部分存在 于该克隆的证据，引物序列为： 5’端引物：5’GACTCGAGAGGGGAAGGGGATGAGTG3’ 3’端引物：5’ATAGATCTCCTGAACCTTGAGCTGG3’ 第二对引物：可以扩增人类ApoAI基因的部分中部序列，即人类ApoAI 基因8106bp到8648bp区域的片段，可以作为人类ApoAI基因中部序列 存在于该克隆的证据，引物序列为： 5’端引物：5’GAGGGCATTACCTGGAGCAG3’ 3’端引物：5’CCTTGCGAGCCACTGATGC3’ 第三对引物：可以扩增人类ApoAIV基因的启动子部分序列，可以作为人 类ApoAI基因全长10.5kb都存在于该克隆的证据，引物序列为： 5’端引物：5’CCTCTATTAGCGATCCATTCCTG3’ 3’端引物：5’TGCTGTGTGAATGGTTGTTAACTG3’ (4)PCR扩增人类全基因组Cosmid文库，以鉴别筛选包含有人类ApoAI 基因的阳性亚文库 (a)PCR扩增所需模板的快速处理：以1×PCRbuffer50ul加2ul(2) 部分(e)步骤中得到的一个孔的稀释菌液，100℃煮沸10min，10000g 离心2min，取上清2ul，加入下述PCR反应体系中，作为PCR反应模板， 对步骤(2)(e)步骤中得到的96孔细胞培养板上96个孔内每一个孔的 菌液都作上述处理后加入下述PCR反应体系，进行PCR反应； (b)PCR反应： 在0.5ml离心管中准备下列试剂： 10×PCRbuffer10ul终浓度1× 2mMdNTP10ul终浓度0.2mM 第一对引物分别为5ul终浓度50pM 经(4)部分(a)步骤处理的模板2ul相当于10⁵个菌的DNA含量 Taq酶1ul终浓度5u/管 去离子水72ul补足反应体积至100ul 混匀后，加入50ul/管石蜡油，放入PCR仪器，按照下列条件 进行PCR扩增： 91℃1min 60℃1min 72℃1min 上述条件反应30个循环后，72℃扩增5min，4℃保存待处理 (c)1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆：上述步骤(4)(a)中 得到的96个样品分别经上述PCR反应，将各PCR产物进行电泳分析， 上样量为10ulPCR产物加2ul5×上样缓冲液，电压为10V/cm，电泳 30min，分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp， 250bp，500bp，750bp，1kb，2kb； 电泳完毕在紫外310nm下观察电泳条带，根据条带的有效位置以及 条带长度来判断扩增的情况，以Cosmid文库中使用的载体pWE15 为模板使用第一对引物进行PCR扩增是可以获得可重复的250bp的 条带，该条带为背景条带，可以剔除；目标序列扩增可以获得400bp 左右的条带，有此条带可以初步说明该克隆是所需要筛选的阳性克 隆，实际筛选获得8个孔的亚文库具有阳性反应，取其中1个阳性 亚文库进行下一步的操作； (5)对人类全基因组Cosmid文库独立克隆进行第二级稀释 (a)取10ul经步骤(4)筛选得到的阳性亚库的菌液，在100倍显微 镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数阳性亚文库的菌 液浓度为10⁸个/ml； (b)取10ul经步骤(4)筛选得到的阳性亚库的菌液，加入1ml 新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的 浓度为10⁶个/ml； (c)取10ul步骤(b)获得的稀释菌液，加入1ml新鲜配置的无菌LB 培养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的浓度为10⁴个/ml； (d)取100ul步骤(c)获得的稀释菌液，加入1ml新鲜配置的无菌LB 培养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的浓度为10³个/ml； (e)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200ul新鲜配制的 无菌LB培养基，加入氨苄青霉素至终浓度为100ug/ml，另外每 孔分别加入(d)步骤得到的稀释菌液10ul，此时每孔中菌液的密 度为10¹个/ml，分布孔的范围为A1-H12； (f)将步骤(e)得到的细胞培养板放入37℃培养箱培养16hr，此时每 孔中菌液浓度为10⁸个/ml，独立克隆数仍然为10¹个/ml，每一个孔内的 菌液形成一个二级亚文库； (6)PCR扩增经过步骤(5)得到的二级亚克隆文库，以鉴别筛选包含有人 类ApoAI基因的二级亚文库 (a)PCR扩增所需模板的快速处理：以1×PCRbuffer50ul加2ul(5) 部分(e)步骤中得到一个孔的稀释菌液，100℃煮沸10min，10000g离 心2min，取上清2ul，加入下述PCR反应体系作为PCR反应模板，对 96孔细胞培养板上96个孔内每一个孔的菌液都作同样处理后加入下述 反应体系，进行PCR扩增； (b)PCR反应： 在0.5ml离心管中准备下列试剂： 10×PCRbuffer10ul终浓度1× 2mMdNTP10ul终浓度0.2mM 第一对引物分别为5ul终浓度50pM 经(6)部分(a)步骤处理的模板2u相当于10⁵个菌的 DNA含量 Taq酶1ul终浓度5u/管 去离子水72ul补足反应体积至100ul 混匀后，加入50ul/管石蜡油，放入PCR仪器，按照下列条件 进行PCR扩增： 91℃1min 60℃1min 72℃1min 上述条件反应30个循环后，72℃扩增5min，4℃保存待处理 (c)1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆：上述步骤(6)(a)中 得到的96个样品经上述PCR反应，将各PCR产物进行电泳分析，上样量为 10ulPCR产物加2ul5×上样缓冲液，电压为10V/cm，电泳30min，分子量 标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp， 750bp，1kb，2kb； 电泳完毕在紫外310nm下观察电泳条带，根据条带的有效位置以及 条带长度来判断扩增的情况，与第一级亚文库相同，以Cosmid文 库中使用的载体pWE15为模板使用第一对引物进行PCR扩增是可 以获得可重复的250bp的条带，该条带为背景条带，可以剔除；目 标序列扩增可以获得400bp左右的条带，有此条带可以初步说明该 克隆是所需要筛选的阳性克隆，实际筛选获得28个孔的二级亚文 库具有阳性反应，此时二级亚文库的独立克隆数为10¹个，对其中 一个二级亚文库进行单克隆细菌平板制备分析； (7)对人类全基因组Cosmid文库单克隆细菌平板制备 (a)取10ul经步骤(6)筛选得到的阳性二级亚文库的菌液，在100倍显 微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数阳性亚库的菌液 滴度为10⁸个/ml； (b)取10ul经步骤(6)筛选得到的阳性二级亚库的菌液，加入1ml新 鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的浓度为 10⁶个/ml； (c)取10ul步骤(7)(b)获得的稀释菌液，加入1ml新鲜配置的无菌 LB培养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的浓度为10⁴个/ml (d)取100ul步骤(7)(c)获得的稀释菌液，加入1ml新鲜配置的无 菌LB培养基，混合均匀，此时稀释过的菌液的浓度为10³个/ml； (e)取100ul步骤(7)(d)得到的密度为10³个/ml的菌液，铺于10cm 细菌培养板上，培养基为LB，含有1.5％琼脂糖，并加入氨苄青霉 素至终浓度为100ug/ml，将细胞培养板在37℃培养约16小时，待 菌落长至平均1mm直径，平均各板上可以长到50-100个菌落； (f)以灭菌牙签挑取单克隆菌落的一半放入装有PCR扩增所需模板的 快速处理液的管中，用于PCR反应，将板上克隆与快速处理液管 进行对应编号，根据PCR反应结果，可以寻找到细胞培养板上对 应的克隆，每一筛选组共挑取50个单克隆； (8)PCR扩增步骤(7)得到的平板单克隆，鉴别筛选包含有人类ApoAI 基因的阳性菌落 (a)PCR扩增所需模板的快速处理：以1×PCRbuffer50ul加灭菌牙签 挑取步骤(7)(f)的一个单克隆，混匀后于100℃煮沸10min，10000g 离心2min，取上清2ul，加入下述PCR反应体系中，将25个克隆 步骤(7)得到的单克隆平板上的50个单克隆菌落都进行同样处理 后作为下述PCR反应体系的模板； (b)PCR反应1： 在0.5ml离心管中准备下列试剂： 10×PCRbuffer10ul终浓度1× 2mMdNTP10ul终浓度0.2mM 第一对引物分别为5ul终浓度50pM 经步骤(8)部分(a)处理的模板2ul相当于10⁵个菌的DNA 含量 Taq酶1ul终浓度5u/管 去离子水72ul补足反应体积至00ul 混匀后，加入50ul/管石蜡油，放入PCR仪器，按照下列条件进 行PCR扩增： 91℃1min 60℃1min 72℃1min 上述条件反应30个循环后，72℃扩增5min，4℃保存待处理 PCR反应2 在0.5ml离心管中准备下列试剂： 10×PCRbuffer10ul终浓度1× 2mMdNTP10ul终浓度0.2mM 第二对引物分别为5ul终浓度50pM 经(8)部分(a)步骤处理的模板2ul相当于10⁵个菌的 DNA含量 Taq酶1ul终浓度5u/管 去离子水72ul补足反应体积至100ul 混匀后，加入50ul/管石蜡油，放入PCR仪器，按照下列条件进行 PCR扩增： 91℃1min 60℃1min 72℃1min 上述条件反应30个循环后，72℃扩增5min，4℃保存待处理； PCR反应3 在0.5ml离心管中准备下列试剂： 10×PCRbuffer10ul终浓度1× 2mMdNTP10ul终浓度0.2mM 第三对引物分别为5ul终浓度50pM 经(8)部分(a)步骤处理的模板2ul相当于10⁵个菌的 DNA含量 Taq酶1ul终浓度5u/管 去离子水72ul补足反应体积至100ul 混匀后，加入50ul/管石蜡油，放入PCR仪器，按照下列条件进行 PCR扩增： 91℃1min 60℃1min 72℃1min 上述条件反应30个循环后，72℃扩增5min，4℃保存待处理 (c)1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆：步骤(8)(b)得到的 PCR反应产物的上样量为10ul，加2ul5×上样缓冲液，电压为10V/cm， 电泳30min，分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为 100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb； 电泳完毕在紫外310nm下观察电泳条带，根据条带的有效位置以及 条带长度来判断扩增的情况，与亚文库相同，以Cosmid文库中使 用的载体pWE15为模板使用第一对引物进行PCR扩增是可以获得 可重复的250bp的条带，该条带为背景条带，可以剔除；而目标序 列扩增可以获得400bp左右的条带，有此条带可以初步说明该克隆 是所需要筛选的阳性克隆以及该克隆包含所需要的人类ApoAI基 因上游起始序列从-300bp到50bp；Cosmid文库载体的pWE15 为模板，用第二对引物进行PCR扩增时可以获得可重复的100bp 的条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得 500bp左右的条带，有此条带说明该克隆包含有人类ApoAI基因的 部分中从8106bp到8648bp的序列，以作为Cosmid文库的载体的 pWE15为模板，用第二对引物进行PCR扩增时没有扩增条带，阳 性单克隆可以扩增得到1.1kb的片段，说明该克隆包含了ApoAIV 基因的调控区，长10.5kb的整个ApoAI的全基因均包含在克隆区 中，实际筛选得到1个单克隆菌落，用第一对，第二对，第三对引 物扩增均可以得到目的片段； (9)对步骤(8)得到的阳性克隆包含的三条目的条带进行部分序列分析 (a)用PCR扩增得到目标阳性条带 PCR反应1 在0.5ml离心管中准备下列试剂： 10×PCRbuffer10ul终浓度1× 2mMdNTP10ul0.2mM 第一对引物分别为5ul50pM 经(8)步骤扩增有目的条带的模板2ul相当于10⁵个菌的DNA含 量 Taq酶1ul终浓度5u/管 去离子水72ul补足反应体积至 100 混匀后，加入50ul/管石蜡油，放入PCR仪器，按照下列条件进行 PCR扩增： 91℃1min 60℃1min 72℃1min 上述条件反应30个循环后，72℃扩增5min，4℃保存待处理 PCR反应2 在0.5ml离心管中准备下列试剂： 10×PCRbuffer10ul终浓度1× 2mMdNTP10ul0.2mM 第二对引物分别为5ul50pM 经(8)步骤扩增有目的条带的模板2ul相当于10⁵个菌的DNA含量 Taq酶1ul终浓度5u/管 去离子水72ul补足反应体积至100ul 混匀后，加入50ul/管石蜡油，放入PCR仪器，按照下列条件进行 PCR扩增： 91℃1min 60℃1min 72℃1min 上述条件反应30个循环后，72℃扩增5min，4℃保存待处理 (b))1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆：上样量为(9)(a)步骤 得到的10ulPCR反应产物加2ul5×上样缓冲液，电压为10V/cm，电 泳30min，分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为 100bp250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；电泳完毕在紫外310nm下观 察电泳条带，PCR反应1扩增得到的目标阳性条带为400bp；PCR反 应2得到的目标阳性条带为500bp； (c)对照分子量标准，将这两段PCR目标阳性片段所在处的琼脂糖凝胶 块割下；用琼脂糖凝胶DNA回收系统回收；回收步骤如下： I割胶：对照分子量标准，用洁净锋利刀片，将步骤(9)(b)所 述的两段PCR目标阳性片段所在处的琼脂糖凝胶块割下，修净边 缘； II称重：将割下的胶在天平上称重，胶重量小于400mg者，放入 1.5ml离心管重，每10mg胶加入30ul溶解液； III溶解：将步骤II装有琼脂糖凝胶的离心管放入50℃水浴锅温浴 15min，每隔3min混匀一次，凝胶溶解后继续水浴5min， IV装柱：取一个Gibco公司提供的洗脱柱放入一个2ml的作为洗涤 管的离心管中，把步骤III的凝胶溶解物倒入洗脱柱中，12000g离 心1min，弃去洗涤管中液体； V将步骤IV的洗脱柱放回2ml洗涤管中，加500μl溶解液，室温 放置1min，12000g离心1min，弃去洗涤管中液体； VI洗涤：洗脱柱放回2ml洗涤管中，加700μl洗涤缓冲液室温放 置5min，离心12000g1min，弃去洗涤管中液体，重复离心1min， 弃去洗涤管； VIIDNA回收：把洗脱柱放入一新的1.5ml离心管中，加入50μl 预热的TE缓冲液，室温放置1min，12000g离心2min，可得到 回收的DNA； (d)将步骤(9)(c)回收得到的两个目标DNA克隆到购自Promega公司 的pGEM-TEasy载体： 在一个新的0.5ml离心管中先后加入如下试剂： 2×快速连接缓冲液5μl 浓度为50ng/ulpGEM-TEasy载体1μl 步骤(9)(c)得到的胶回收的目的DNA3μl 浓度为3U/μl的T4DNA连接酶1μl 去离子水补充体积至10μl， 将含有连接液的离心管放入4℃连接反应过夜； 连接后的载体命名为pGEM-T/apo (e)细菌转化 取JM109感受态菌液200μl于离心管中，加入步骤(9)(d)获得 的命名为pGEM-T/apo的载体质粒4μl，轻轻混匀，将离心管冰上 放置30min；然后将该离心管放入42℃水浴，热休克90秒，不摇 动试管；热休克后，在离心管中加入无抗生素的LB培养基800μl， 在37℃摇床以150rpm摇动离心管45min；然后将离心管于5000g 离心30秒，吸去上清约800μl，加入购自Promega公司的X-gal， 混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表 面，将平板37℃平放20min后倒置培养10-14hr；次日挑取白色 菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床180rpm 摇动培养12hr； (f)质粒提取 取步骤(9)(e)获得的菌液，放入1.5ml离心管中，于4℃4000g 离心10min，弃上清，倒置试管，滴尽残存液体；在离心管内加入 100μl溶液I，漩涡振荡后完全重悬菌体；再加入200μl溶液II， 轻柔颠倒离心管4次；然后加入150μl溶液III，12000g离心10min； 从离心管中将上清移到另一离心管中，加入等体积450μl苯酚氯 仿异戊醇混合液，混匀后，12000g离心10min；小心吸取离心管内 上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后将离心管放入-70℃冰箱放置 30min，然后12000g离心15min；弃上清后，在离心管内加500μl 冷75％乙醇轻洗离心管壁后，10000g离心5min，弃尽上清后，将 离心管放于37℃静置干燥10min；用50μlPH7.4，含10mg/ml的 RNaseA的TE溶液溶解质粒，得到质粒pGEM-T/apo； 所述的溶液I：50mm葡萄糖，25mmolTris-HclpH＝8.0，10mmol EDTApH＝8.0，配制200ml 溶液II：0.2molNaOH，1％SDS，配制100ml 溶液III：5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子 水28.5ml (g)酶切鉴定克隆质粒pGEM-T/apo 在一个新离心管中依次加入以下反应物及试剂： 去离子水6μl 10×专用限制性内切酶缓冲液2μl 限制性内切酶BglII和XhoI各1μl 质粒pGEM-T/apo10μl 去离子水补充到总体积为20μl 将离心管瞬时离心混匀管内液体， 将离心管置于37℃水浴1-1.5hr，1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别， 上样量为20ul酶切产物加5ul5×上样缓冲液，电压为10V/cm， 电泳30min，分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分 别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；电泳完毕在紫外 310nm下观察电泳条带，可见相应大小的400bp和500bp的目标片 段； (i)对400bp和500bp的目的条带做测序分析 将经过步骤(9)(g)证明正确的质粒载体，以T7promter作为 序列分析引物，交上海生工公司做序列测定，测序结果发现400bp 和500bp的目的条带的序列均与基因库内发表的编号为 gi：178765的人类ApoAI基因序列部分一致，结果如下： 400bp序列： 01TGANNCCNTGGGATACCCCGANCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCT 61CCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCA 121CTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCC 181AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCT 241GGCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAGACTGCGAGAAGGAGGT 301GCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTC CCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTATA 该段序列与人类ApoAI基因-300bp到50bp区域序列相对应； 500bp序列： GCCGCGGGAATTCGATT GAGGGCATTACCTGGAGCAGCTGCCTCTAGGGATGAACTGAGCAGACAGGCAGGAGGG TTCTGACCTGTTTTATATCATCTCCAGGGCAGCAGGCACTGAGGACCCAGGGCGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTG ACCAGTGGAGATGAGGGCCTGAGGCAGGGTGTCCAGATGCAGCAAGCGGGCGGGAGAGTTGGGAAATCCCTAGGA GACTGAGTCCACGCTGCTGTCCCGCCAGCCCTGCAGCCCAGATGAGCTCAGGAACTGGGGGTGGGCCTGGGGAGC CTCATTCCTTCCTAGCTGACTGGCTCCCCAGGGAGAGGCTGGTGAGAGGGGAAATGGCTTGGACATAGGCCAGCG CTCGGGCCCATCTCAGCCTTTCACACTGGAATTTCAGGCCCCTCCCTCCACCAGCCCCAAGCCCTGAACACAGCC TGGAGTAGAGGGGTGAGGGGCTTCTTCAGACTTGAGAACAAGTGGGTGGCTTGGGCTGGGGGGTGTTTGGAGTAA AGGCACAGAAGACCG GGCATCAGTGGCTCGCAAGGCCTGGGCATAGCTTGAYGTATTTTATAGTGTCACCTAAAT AGCTTNGGCGTAATNATGGCCATAAGCTGNTTTCCTTGNGGNGNAAATTGNTNTTTCCGCTTCACAAATTCCNCA CAAACAATACCAAGCCCGGAAGCANTAAAGGNGGGAAAAGNCCTGGGGGGGGCCTAAATGGAGGGGAGCCTTAAC CTCNCNATTTAATTTGNGTTTGGCGCTTCNCTTGGCCCCCNT 该段序列与人类ApoAI基因8106bp到8648bp区域序列相对应； 下划线部分为设计的引物序列 该结果说明我们获得的序列为人类ApoAI基因的序列；获得的 400bp片段和500bp片段序列都与基因库中发表的人类ApoAI基因 序列一致，说明获得的人类ApoAI基因是完整的。