[发明专利]脱氧核糖核酸分子的通用捕集法

摘要

本发明涉及一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，可应用于分子医学的疾病诊断。本方法包括预杂交、杂交、洗板、酶联、洗板、显色、光密度测定等步骤。利用接头液分子的特异性部分与病原体核酸分子的杂交及通用部分与共价键地固定在通用捕集孔上的通用捕集寡核苷酸分子杂交而应用于临床检测。该法与直接法相比较，具有杂交特异性强，杂交效率一致、灵敏度高、操作方便、能做定性定量及分型等多种检测、临检效率高、成本费用低等特点，适合日益增多的临检需要。

主权项

1.一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法，其特征在于：包括下列操作步骤：A)预杂交：取12.5微升的1.6毫微克/微升接头分子液加入到盛有100微升杂交液的通用捕集孔中，37℃保温1小时，进行预杂交反应形成通用捕集杂交链，然后弃去孔中剩余液；B)杂交：取100微升上述杂交液加入到上述孔中，取待测的生物样品40微升PCR反应液与40微升变性液的混合液25微升加到上述孔中，37℃保温1小时进行杂交链反应；C)洗板：用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；D)酶联：取50毫微克/毫升的酶联液100微升加入到上述孔中，37℃保温15分钟进行酶联反应：E)洗板：用洗涤液对孔中反应产物进行洗涤5次，每次用量300微升，然后弃去洗涤液；F)显色：孔中加入显色液100微升，25℃保持10分钟后加入停显液100微升；G)测定：上述样品移至在波长450毫微米的酶标仪上测定光密度数；其中步骤A)的接头分子液为a)乙型肝炎病毒接头分子液；或b)丙型肝炎病毒接头分子液；或c)丙种球蛋白接头分子液；或d)爱滋病毒接头分子液；或e)结核菌接头分子液；或f)沙眼衣原体接头分子液；上述接头分子的结构为一条单链的寡核苷酸，其长度在50至60个碱基对左右，它包括三个组成部分：通用部分：通用部分共长25个碱基，恰好和固定在磁粉或微量板上的通用探针互补，能很快地与通用探针杂交；“空间”：介于通用部分和特异性部分之间，为了留出“空间”给二个分子形成夹心式的杂交链，我们的“空间”长度是5到4nm；特异性部分：特异性部分紧接着“空间”，约为22-26个碱基，它的长短是由它本身的G/C％，Tm是否与通用部分配合所决定的，也决定于它自身是否有二级级构，它的顺序是选用在PCR产物，介于一对引物的中间顺序，因而只能和PCR的产物杂交而与生物素标记的引物无反应，所以保证了该部分杂交的特异性；接头液的分子结构：1)其中通用部分长25个碱基对，其顺序或用人为排列的(dA)25或5′-ACg，Acg，gAA，cgA，AAc，ggA，Acg，Acgg-3′或从pBlue?KS--质粒顺序中选取一段顺序；具体顺序为：3′-CCg，AgA，TAg，ggT，TgA，gTg，TTg，TTCC-5′2)空间由二个空间分子(spacer-phosphoramidite)组成，每个空间为18个碳原子组成的一个长臂，可以在DNA合成仪上加入到接头分子中；具体结构为：3)特异性部分：都选自各待测病原体核酸的全序列中，HBV，HCV，HIV，TB，CT，β-globin都可在“基因文库”中查找出来；它们的具体结构为：(1)HBV?5′-TAAAGAGAGGTGCGCCCCGTGGTC-3′(2)HCV?5′-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3′(3)HIV?5′-GTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAA-3′(4)TB?5′-GCGCTTTAGCGGTGTGGGATGA-3′(5)CT?5′-GATGAAAGACAGGAAATACGCATGA-3′(6)丙种球蛋白5′-ACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCT-3′