[发明专利]基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法和试剂盒,属分子生物学检测领域。具体的是从基因改造农作物及其加工产品中提取脱氧核糖核酸(DNA),应用实时多聚酶链式反应(real－timePCR)技术对基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分(geneticallymodifiedorganisms,GMOs)进行定量检测的方法和试剂盒。采用本发明的方法和试剂盒,可以定量地判定一种农作物或其加工产品是否含有基因改造成分。

主权项

1.基因改造农作物及其加工产品的定量检测方法，包括如下步骤：第一步、基因改造农作物及其加工产品DNA的提取(一)待测样品的前处理：粉末状的待测样品不需处理；非粉末状的固体待测样品要处理成粉末状；液态待测样品采用冷冻干燥法干燥并研碎成粉末状；新鲜的待测样品清洗干净即可：(二)提取待测样品的DNA，方法如下：DNA的提取方法一：(1)称取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)离心管中，缓慢加入700微升(μl)CTAB提取缓冲液(0.1MTris-Cl，1.4MNaCl，20mMEDTA，20g/LCTAB，pH8.0，使用前加入体积比为1％的巯基乙醇)，充分混匀；若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有700μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品；(2)将离心管置于60℃水浴中，放置45分钟，期间混匀数次；(3)加入等体积氯仿，充分混匀；(4)室温下12,000rpm离心10min；(5)将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍；(6)将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，充分混匀；(7)将混合液通过一个过滤柱(column)；(8)用2ml清洗缓冲液(80mMKAC，8.3mMTris-HCl，40uMEDTA，pH7.5)清洗过滤柱(column)，重复一遍；(9)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；(10)向过滤柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟；(11)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；(12)收集洗脱液；(13)用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用；DNA的提取方法二：(1)称取200mg食品粉末，放入1.5ml离心管中，缓慢加入860μl提取缓冲液(10mMTris，150mMNaCl，2mMEDTA，1％SDS，pH8.0)，充分混匀；若是新鲜食品，则直接称取200mg放入盛有860μl提取缓冲液的1.5ml离心管中，用镊子在缓冲液中捣碎食品；(2)加入100μl5M盐酸胍溶液，混匀；(3)加入40μl20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀；(4)将离心管置于60℃水浴中，放置3小时，期间混匀数次；(5)在室温下冷却5分钟；(6)室温下13,000rpm离心10min；(7)将上清转移到一个新的离心管中，加入等体积氯仿，充分混匀；(8)室温下12,000rpm离心10min；(9)将上清转移到一个新的离心管中，重复氯仿抽提过程一遍；(10)将上清转移到一个新的离心管中，加入1ml树脂，充分混匀；(11)将混合液通过一个过滤柱(column)；(12)用2ml清洗缓冲液(80mMKAC，8.3mMTris-HCl，40uMEDTA，pH7.5)清洗过滤柱(column)，重复一遍；(13)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；(14)向过滤柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，温育5分钟；(15)室温下11,000rpm离心过滤柱(column)2min；(16)收集洗脱液；(17)用紫外分光光度计测定DNA的浓度，稀释成终浓度为50ng/μl，储存于-20℃冰箱，备用；第二步、利用实时PCR(real-timePCR)技术定量检测基因改造农作物及其加工产品中的基因改造成分(一)确定检测标记及对照基因选定下列要素作为检测标记：存在于植物基因转化过程中所使用的大部分的植物转化中间载体中的CaMV35S启动子、Nos终止子、抗生素筛选标记基因NPTII以及除草剂筛选标记基因Bar；存在于Monsanto公司的“RoundupReady”抗除草剂大豆中的基因改造成分EPSPS基因；存在于Novartis公司的“Event176”抗虫玉米中的CryIA(b)基因；同时，选择大豆特异基因Lectin和玉米特异基因Invertase作为对照基因；(二)确定Real-timePCR标准曲线选定混有基因改造的“RoundupReady”5％的大豆和混有基因改造的“Event176”5％的玉米的DNA，分别稀释成浓度为20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，各取5ul作为模板，进行Real-timePCR反应，则形成相对于内源基因(Lectin和Invertase)为100，50，10，5，1，0.2ng的标准曲线，形成相对于基因改造成分EPSPS和CryIA(b)为5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng的标准曲线；对应标准曲线，就可以计算出所检测的样品中所含大豆(或玉米)成分的比例，以及基因改造的“RoundupReady”大豆(或“Event176”玉米)的比例；(三)鉴定检测体系的可靠性和灵敏度选定混有基因改造的“RoundupReady”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品定量检测体系的可靠性；按照前面所述的DNA提取方法，分别提取它们的DNA，各取100ng作为模板，分别对各个检测标记和对照基因进行Real-timePCR扩增，同时设立用重蒸水代替DNA模板的空白对照；只有当检测结果如下时，才能证明检测体系的可靠性：以重蒸水代替DNA模板的空白对照，不能扩增出任何检测标记和对照基因；“RoundupReady”0％的大豆，只能够扩增出大豆特异的Lectin基因；“Event176”0％的玉米，只能够扩增出玉米特异的Invertase基因；“RoundupReady”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能够扩增出大豆特异的Lectin基因，且含量基本相同，变异系数在1％以内；“Event176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能够扩增出玉米特异的Invertase基因，且含量基本相同，变异系数在1％以内；“RoundupReady”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能够扩增出EPSPS基因，且EPSPS基因的含量随样品中“RoundupReady”含量的上升而呈上升趋势；“Event176”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能够扩增出CryIA(b)基因，且CryIA(b)基因的含量随样品中“Event176”含量的上升而呈上升趋势；选定混有基因改造的“RoundupReady”5％的大豆(或混有基因改造的“Event176”5％的玉米)的DNA，分别稀释成浓度为20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，作为标准来鉴定基因改造农作物及其加工产品定量检测体系的灵敏度；各取5ul作为模板，进行Real-timePCR反应，则相对于基因改造成分EPSPS(或CryIA(b))，模板的含量分别为5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng；如果EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng和以上的大豆(或玉米)的DNA模板，可以扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且检测出的基因含量随样品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趋势，则此时检测体系的灵敏度为0.01ng，即该检测体系最低可以检测出的基因改造成分含量为0.01ng；若无法从EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng大豆(或玉米)中扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，而可以从EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.05ng和以上的大豆(或玉米)中扩增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且检测出的基因含量随样品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趋势，则此时检测体系的灵敏度为0.05ng，即该检测体系最低可以检测出的基因改造成分含量为0.05ng；依此类推；(四)确定基因改造农作物及其加工产品的定量检测PCR引物和探针所扩增的片段长度在50-150碱基对(bp)之间，5`端不能出现连续的G，引物的复性温度在58-60℃之间，探针的复性温度比引物的复性温度高10℃；我们选定符合以上条件的PCR引物和探针的位置范围见下表：基因改造农作物及其加工产品的定量检测PCR引物和探针位置范围列表(表一)基因名称引物和探针GenBank序列号位置范围CaMV35启动子5`引物AJ2510142221-27013`引物正向探针Nos终止子5`引物U840062801-30413`引物正向探针NPTII基因5`引物Y183163541-43113`引物正向探针Bar基因5`引物X1722041-5813`引物正向探针EPSPS基因5`引物I439985-19813`引物正向探针Lectin基因5`引物K008211001-18013`引物正向探针CryIA(b)基因5`引物I414195-19213`引物正向探针Invertase基因5`引物U161235-42113`引物正向探针(表一)(五)确定PCR反应体系PCR反应体系如下：TaqManbufferA1×MgCl24mMdATP0.2mMdCTP0.2mMdGTP0.2mMdUTP0.4mMAmpliTaqGodDNApolymerase0.025U/μlAmpEraseUNG0.01U/μlPrimer0.2μMTaqManProbe0.2μMDNAtemplate100ng(样品)重蒸水补至25μl(六)确定PCR反应条件PCR反应条件如下：50℃2分钟，95℃10分钟，然后在如下条件进行50个循环：95℃15秒和60℃1分钟；第三步、对检测结果进行解释在检测体系的可靠性得到确认以后，对基因改造农作物及其加工产品的定量检测结果解释如下：如果得到Lectin基因的含量(以X表示，单位为ng)，则证明该样品中含有大豆成分，且大豆的含量为X％；如果同时得到Lectin基因的含量(以X表示，单位为ng)和EPSPS基因的含量(以P表示，单位为ng)，则证明该样品含有基因改造成分，且所含的大豆中(P/X)％为“RoundupReady”基因改造大豆；如果得到Invertase基因的含量(以Y表示，单位为ng)，则证明该样品中含有玉米成分，且玉米的含量为Y％；如果同时得到Invertase基因的含量((以Y表示，单位为ng)和CryIA(b)基因的含量(以Q表示，单位为ng)，则证明该样品含有基因改造成分，且所含的玉米中(Q/Y)％为“Event176”基因改造玉米。