[发明专利]一株重组广谱苏云金芽孢杆菌

摘要

本发明公开了一种既杀鳞翅目又杀鞘翅目害虫的广谱重组苏云金芽孢杆菌LCJ-12，该菌株具有稳定高效且广谱性的杀虫效果，使用其制成的杀虫剂具有多种杀虫特性，节约了生产成本和使用成本，提高了经济价值，且对人、畜及其它动植物无害，不污染环境，具有良好的经济、生态效益，有着良好的推广应用前景。其急性毒性和生态安全性获准了农业部遗传工程体中试级安全性评价和野外释放级安全性评价。

主权项

1、一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12(Bacillusthuringiensis LCJ-12)，其特征在于，该菌株具有如下特性：a、含有杀鳞翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因cry1Ac和杀鞘翅目昆虫的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质基因cry3A，b、产生菱形和四方形两种杀虫晶体蛋白质，c、可同时杀鳞翅目昆虫和杀鞘翅目昆虫，d、含有穿梭重组质粒pHT304/1Ac10；该菌株由下列方法制备：a、采用保藏号为CCTCC NO：M 201003的菌株作为苏云金芽孢杆菌的受体菌，该菌株含cry3A基因；采用pHT304/1Ac10重组质粒，该重组质粒含杀鳞翅目昆虫的cry1Ac基因；b、在含有氨苄青霉素的LB培养基中接种含重组质粒pHT304/1Ac10的大肠杆菌，35-37℃剧烈摇晃培养8-12小时，将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈震荡，加200μl溶液II；加150μl用冰预冷的溶液III，于4℃下12000g离心10分钟，用等量酚-氯仿-异戊醇抽提上清液，用2倍体积上清液的乙醇于一20℃沉淀DNA，得到重组质粒pHT304/1Ac10；c、将受体菌接种在LB培养基中，28-30℃摇动培养8-10小时后，冰浴20-30分钟，在4℃下12000g离心10分钟，先用电击洗脱液洗两次，再用电击缓冲液洗一次，最后悬浮在电击缓冲液中，得到受体菌电击感受态细胞，置-20℃保存；d、将pHT304/1Ac10质粒DNA与受体菌感受态细胞悬液充分混均，取200μl注入电击转化杯中，用E.coli Gene Pulser大肠杆菌电击转化仪在2.5KV下电击一次，将电击液转入4mlLB培养基中，28-30℃振动培养2小时后，涂布于含红霉素20μg/ml的LB平板上，28-30℃下培养3天；e、在20μg/ml的红霉素抗性平板上挑选单个菌落，涂片镜检，选取具有苏云金芽孢杆菌特征的菌落在红霉素平板上传代，以检测其稳定性，经过二十代的遗传传代和毒力生物测定及PCR检测，获得毒力最高的并含有cry1Ac及cry3A基因的重组广谱苏云金芽孢杆菌，即为本发明的一株重组广谱苏云金芽孢杆菌LCJ-12。