[发明专利]一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法，其步骤是：首先合成编码聚赖氨酸的DNA链，将合成的DNA链在65℃褪火形成双链的短DNA片段；其次是通过基因拼接，构建融合蛋白的表达载体pPICGLT；第三是表达载体pPICGLT经限制性内切酶StuI线性化后，用原生质体转化法转化进酵母中；第四是酵母重组子的筛选，提取酵母的基因组DNA作检测；第五是融合蛋白的表达、纯化，转化子在30℃下MM培养基中培养72小时，每24小时加一次甲醇；第六是融合蛋白与介体的连接；第七是葡萄糖传感器的制备；第八是电化学检测。本发明制备葡萄糖传感器测量线性范围宽，可达45mmol/L，且响应信号大，保存期长。

主权项

1、一种用于葡萄糖传感器的融合蛋白的制备方法，它包括下列步骤：A、该合成的DNA链应编码聚赖氨酸并且该两端具有克隆所需要的酶切位点：5′-agctt，aag，aag，aag，aag，aaa，aag，aag，aaa，aag.aag，gc-3′5′-ggccgc，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ttt，ctt，ctt，ctt，ctt，a-3；B、通过基因拼接，构建融合蛋白的表达载体pPICGLT，上述合成的DNA链在65℃褪火形成双链的短DNA片段，质粒pGEM-TGL DNA用限制性内切酶SnaB I和HindIII双酶切，琼脂糖电泳回收片段，质粒pPIC9 DNA用SnaB I和NOtI双酶切回收片段；C、表达载体pPICGLT经限制性内切酶Stul线性化后，用原生质体转化法转化进酵母Pichia pastoris GS115中；D、酵母重组子的筛选，提取酵母的基因组DNA作PCR检测；E、融合蛋白GLT的表达、纯化，转化子在30℃下在MD培养基中培养，离心收集酵母细胞，将细胞重悬于10ml液体MM培养基中，每24小时向培养物中补加2ml甲醇，培养约72小时，离心收取上清液，用强阴离子交换柱Q-Sephorose Fast Flow纯化柱纯化；F、融合蛋白GLT与介体的连接，融合蛋白中的聚赖氨酸链上的氨基酸与介体二茂铁甲酸上的羧基通过缩水反应连接；G、葡萄糖传感器的制备，取经介体修饰的酶各2μl滴于工作电极的工作面积上，在室温下干燥后，在电极表面覆盖一层醋酸纤维膜，切成单个的电极，置于4℃干燥器中备用；H、电化学检测，将制备好的介体酶电极与电化学系统连接，用微量注射器取20μl待测样品滴于电极表面，启动电化学系统进行循环伏安扫描，电化学检测便开始启动，加缓冲液在30秒的电流值被记录下来进行实验分析。