[发明专利]一种生态安全型根瘤菌制剂生产工艺与方法

摘要

本发明属于微生物根瘤菌分子生物学技术领域。其特征在于提出一种生态安全型根瘤菌制剂的生产工艺和方法，该根瘤菌只能在人工控制条件下生长繁殖并发挥其作用，在土壤、河流、湖泊和海洋等自然环境中将因得不到必需的营养物而死亡。本发明的要点是通过根瘤菌必需基因突变株的筛选，必需基因purL结构基因的克隆，诱导表达purL基因的克隆，从而构建、筛选得到生态安全型重组根瘤菌，以该菌为原料制成一种生态安全型根瘤菌制剂。

主权项

1、一种构建并筛选生态安全型重组根瘤菌的的方法，其特征包括如下步骤：(1)根瘤菌必需基因突变株的筛选：以费氏中华根瘤菌为出发菌，采用定位诱变将发光酶标记基因luxAB插入purL基因后克隆到不能在根瘤菌细胞内复制的自杀质粒上，经转化导入根瘤菌株后从野生型出发菌中筛选获得稳定的嘌呤合成酶基因缺陷的PurL-突变株；(2)必需基因purL结构基因的克隆：根据已报道的purL基因的编码区5’和3’端序列再加上与拟用克隆载体的克隆位点相适合的限制性内切酶位点设计并合成出一对引物，从供试菌基因组中扩增出purL基因的结构基因，经与同样双酶切并能在根瘤菌和大肠杆菌细胞内均能复制的穿梭载体连接后转化大肠杆菌，筛选获得含有purL结构基因重组质粒的转化子，从中分离出以purL基因为报告基因的启动子探针载体；(3)诱导表达purL基因的克隆：根据费氏中华根瘤菌共生条件下诱导表达的fixK基因启动子区的DNA序列、purL结构基因和穿梭载体的要求设计并人工合成出含有相应双酶切位点的诱导型启动子序列，用于与经同样双酶切的(2)步骤中所构建的启动子探针载体连接，构建成含有诱导表达purL基因的重组质粒；(4)生态安全型重组根瘤菌的构建与筛选：用步骤(3)中获得的含诱导型表达purL基因的重组质粒转化在步骤(1)中得到的PurL-突变株，在编号为SM基本培养基和YMA平板上筛选转化子，只有在YMA上生长、SM上不生长者才是需要的生态安全型重组费氏中华根瘤菌。