[发明专利]双参数细胞周期分析方法

摘要

本发明公开了一种双参数细胞周期分析方法，主要解决现有分析方法中不能将细胞周期区分得更为详细的不足。该方法将鼠抗人细胞周期蛋白E单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白A单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按1～16∶1～16∶800的体积比混合，组成鼠抗人细胞周期蛋白E和A单克隆抗体的混合抗体，利用此混合抗体以及碘化丙啶和核糖核酸酶混合液对所要分析的各种细胞包括肿瘤细胞和正常细胞进行染色，并通过流式细胞仪对其进行荧光检测，从而获得细胞周期蛋白E+A表达情况的二维等高图，在图中人们可以清晰地将细胞周期区分为G0期、早G1期、晚G1期、S期、G2期和M期六个细胞群体。该方法能减少检测误差，节约样本细胞量，并对肿瘤的研究分析和治疗有很强的指导意义。

主权项

1.一种双参数细胞周期分析方法，包括以下步骤：1)取经70～80％冰乙醇固定至少2小时以上的浓度为2～8×105个/毫升的细胞2～4毫升，离心去除固定液，用磷酸盐缓冲液清洗一遍；2)在步骤1)所得的细胞中加入0.5～1毫升的表面活性剂，并放置5～10分钟；3)用2～4毫升磷酸盐缓冲液将步骤2)所得的细胞清洗一遍，再吸干残液；4)配制鼠抗人细胞周期蛋白单克隆混合抗体：将鼠抗人细胞周期蛋白E单克隆抗体、鼠抗人细胞周期蛋白A单克隆抗体和小牛血清白蛋白液按1～16∶1～16∶800的体积比混合，组成鼠抗人细胞周期蛋白E和A单克隆抗体的混合抗体，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为0.01克/毫升；5)将步骤3)所得的细胞与0.05～0.2毫升步骤4)所配制的混合抗体充分混合均匀，并在温度为2～8℃的条件下放置30分钟～48小时；6)用2～4毫升磷酸盐缓冲液将步骤5)中经混合抗体孵育后的细胞清洗一遍，再吸干残液；7)配制异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液：将异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白和小牛血清白蛋白液按1∶10～20的体积比混合，其中小牛血清白蛋白液中小牛血清白蛋白与磷酸盐缓冲液的质量体积比为0.01克/毫升；8)将步骤6)中经清洗过的细胞与0.05～0.2毫升步骤7)所配制的异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠免疫球蛋白液充分混合均匀，并在室温条件下避光放置20～30分钟；9)用磷酸盐缓冲液将步骤8)中经荧光素标记的细胞再清洗一遍；10)配制碘化丙啶和核糖核酸酶混合液：将碘化丙啶与核糖核酸酶同置于磷酸盐缓冲液中稀释，使碘化丙啶的浓度为0.005～0.1毫克/毫升，核糖核酸酶的浓度为0～0.01毫克/毫升；11)将步骤9)中经清洗过的细胞与0.5～1毫升步骤10)所配制的碘化丙啶和核糖核酸酶混合液相混合，室温避光放置20～30分钟，用流式细胞仪对其进行检测即可。