[发明专利]一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法

摘要

本发明公开了一种从发酵液中分离提取埃博霉素(Epothilone)的方法，它是利用混合树脂吸附、固液分步萃取、分子筛层析、结晶和高效液相分离等技术手段，从粘细菌发酵液中分离提取埃博霉素，获得高纯度的抗肿瘤化合物。并且，埃博霉素A和B的提取得率达到了80％以上，降低了成本，提高了效率，大大提高了工业化生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益。

主权项

1.一种从粘细菌发酵液中分离提纯埃博霉素的方法，该方法具体步骤顺序如下：(1)混合树脂的配制：将CD180，CAD-40，XDA，S-8，NKA-II，AB-8六种树脂按重量比0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.8～2.2∶0.8～1.2∶2.8～3.2∶1.8～2.2混合，悬溶于等体积的蒸馏水中，制备成混合树脂溶液；(2)混合树脂吸附：在进行粘细菌发酵时，向液体培养基中添加0.1％-5％(体积/体积)的上述混合树脂进行吸附，吸附剂存在于整个发酵流程之中，发酵结束后，过滤制得沉淀的吸附树脂混合物，备用；(3)固液分步萃取：①使用10-20倍体积的甲醇对步骤(2)获得的树脂混合物进行萃取，保温30-50℃，24-48小时，离心除去树脂，获得第一部分萃取物；②将第一部分萃取物中的甲醇40℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍体积的二氯甲烷进行第二步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心除去沉淀，获得第二部分萃取物，③将第二部分萃取物中的二氯甲烷30℃真空蒸干，粉碎萃取物，使用10-20倍体积的正己烷进行第三步萃取，保温20-30℃，24-48小时，离心收集沉淀，使用10％体积比的正己烷冲洗沉淀，获得第三部分萃取物；(4)分子筛层析：将上述第三部分萃取物重溶于2倍体积甲醇，以2-5％柱床体积的加样量进行葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)分子筛柱层析分离；流动相为甲醇或二氯甲烷，流速为0.5柱床体积/小时，检测波长254nm，埃博霉素的洗脱体积为1.5-2.5倍柱体积；(5)结晶：将步骤(4)的收集样品制备成酮类的过饱和溶液，利用结晶器制备和收集结晶；方法是将恒温槽加热至45-60℃，将样品放入结晶皿中，保温15-30分钟，至样品全部溶解，然后开始梯度降温，速率为0.5～3℃/30分钟，降温至35-40℃后，改用溶剂蒸发法，恒温浓缩液体体积至原始体积的十分之一，在结晶皿底部可获得大量的白色粉末状结晶，即为埃博霉素A和B的混合物；(6)高效液相分离：若获得完全纯化的埃博霉素A或B，可采用高效液相进行埃博霉素A和B混合物分离，使用反相半制备柱(Hypersil ODS2 C18)，规格为250×8mm，填料粒径10μm，流速为2ml/min，249nm检测，柱温24℃，进样量100μl，检测时间30min，流动相为65％甲醇和35％水；埃博霉素A的滞留时间为9.6分钟，埃博霉素B的滞留时间为11.1分钟；收集后即可获得纯化的埃博霉素A或B。