[发明专利]可溶性血小板T细胞活化抗原1的定量检测方法

摘要

本发明公开了一种可溶性血小板T细胞活化抗原1(CD226)双mAb夹心ELISA定量检测方法。首先制备了多株可识别CD226/PTA1分子胞膜外区的不同表位的mAb，并通过交叉配对选择出可用于夹心ELISA的最佳搭配，然后对工作条件进行了优化，具体步骤是：用缓冲液稀释包被mAb LeoA1，保湿，4℃放置24h。用洗涤液洗板，加入工作浓度标准品CD226/Fc融合蛋白和待测标本，37℃孵育45min。洗板，加入工作浓度的HRP-FMU3，37℃孵育45min。洗板，以TMB底物显色，2.5mol/L H2SO4终止。于波长450nm测定光吸收(A)值。以标准品的A值和相应浓度作标准曲线，将待测标本的A值与标准曲线相比，计算待测标本的sCD226/PTA1水平。本发明提高了检测sCD226/PTA1的敏感性和特异性，有良好的稳定性和再现性，缩短了操作时间，降低了成本。

主权项

1.一种可溶性血小板T细胞活化抗原1的定量检测方法，其特征在于，包括 以下步骤： 1)用含0.5MNa₂CO₃-NaHCO₃的包被缓冲液，稀释抗可溶性血小板T细胞活化 抗原1的包被单克隆抗体至2.5mg/L，按每孔100μl加入96孔板中，4℃放置24 小时； 2)用含0.15M磷酸盐缓冲液、0.1％牛血清白蛋白和0.1％土温20的洗涤液， 洗涤3次后，按100μl/孔加入工作浓度的可溶性血小板T细胞活化抗原1标准品 和待测标本，37℃孵育45分钟； 3)洗涤3次后，按100μl/孔加入浓度为1.36mg/L的辣根过氧化物酶标记的 抗可溶性血小板T细胞活化抗原1的标记单克隆抗体，37℃孵育45分钟； 4)洗涤3次后，加入底物显色，并于410nm波长处测定吸光值； 5)以标准品的吸光值为纵坐标，以相应浓度为横坐标，作标准曲线；根据 待测标本的吸光值，从标准曲线查得待测标本的可溶性血小板T细胞活化抗原1 的含量。