[发明专利]一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法

摘要

本发明提供了一种准确、快速从天然产物中筛选具有抑菌生物活性的蛋白质多肽类物质的方法。克服了现有技术不能有效解决筛选速度、通量、准确率三者统一的弱点。该方法包括了等电聚焦，恒压电泳，电印迹，细菌培养及微量鉴定，将高通量的分离方法和高精度的活性锁定方法结合起来，能够在细胞水平上直接筛选出具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽，运用该方法每循环的操作时间约为一周。

主权项

1.一种筛选具有抗菌活性的肽类物质的方法，该方法的步骤为：A：将蛋白质组样品经过丙酮预处理以降低杂质含量；B：将处理过的样品在非变性条件下进行等电聚焦IEF，IEF之后从凝胶上切下两根宽度相同的IEF胶条，在缓冲液A中平衡后进行第二向的聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺制备非变性凝胶，上槽缓冲液的组分为Tris-base，Tricine和SDS，恒压电泳至溴酚蓝前缘到达底部；C：将PAGE所得的两块胶分别处理，一块胶用考马斯亮蓝CBB染色，脱色后用做备份，另一块胶则经电印迹，将蛋白质斑点转移到NC膜上，使用不含SDS的缓冲液A；D：经过0.01～0.2M Tris-Cl，pH＝7.5的缓冲液漂洗除去SDS，将NC膜真空干燥；E：在NC膜上均匀地分布细菌，使其密度达到1×103～1×105CFU/mm2后，将膜置于牛肉膏固体培养基上培养，该培养基含显色剂；同时含有细菌生长所需的底物，该底物经细菌代谢能产生酸性产物；在NC膜上正常生长的细菌由于其代谢产物呈酸性因而在其周围呈亮黄色，而有抗菌肽斑点的地方细菌生长受抑制，故而和周围呈现出色差，为暗色的斑点；F：将NC膜上的斑点与双向电泳所得到的凝胶上的斑点相对照，将凝胶上对应于NC膜上抗菌肽色斑的斑点切下，然后对这些斑点用质谱指纹图，N端序列分析，氨基酸组成分析进行微量鉴定。