[发明专利]重组人骨形态发生蛋白－2微量免疫法的建立及抗体的制备

摘要

本发明公开了一种重组人骨形态发生蛋白－2微量免疫法的建立及抗体的制备，通过建立两种微量免疫方法免疫家兔，进行rhBMP₂抗原不同免疫方式的抗原剂量与抗血清效价间的比较研究，再用盐析、离子交换剂及去载体蛋白等步骤将rhBMP₂抗血清制备成rhBMP₂ IgG抗体。本发明可获得高效价、特异的抗体并比常规免疫法节省抗原12.37倍。对骨科的临床研究有广泛的应用价值并可用于相关疾病的基础研究。医院及科研机构可应用此抗体作为基础试剂，研制各类标记抗体，开发免疫组化试剂盒。

主权项

1.一种重组人骨形态发生蛋白-2微量免疫法的建立及抗体的制备，其特征在于：建立两种微量免疫方法免疫家兔，进行rhBMP2抗原不同免疫方式(弗氏不完全佐剂及水剂的给药次数不同)的抗原剂量与抗血清效价间的比较研究，获得高效价的抗体，再采用盐析、离子交换剂及去载体蛋白等步骤将rhBMP2抗血清制备成rhBMP2 IgG抗体。包括以下步骤；(1)rhBMP2-BSA复合物的制备(采用戊二醛法)：将高纯度的rhBMP2与载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)通过双功能试剂(戊二醛)交联，连接成rhBMP2-BSA复合物。方法：称rhBMP2 5mg，BSA 8.5mg，用6M的盐酸胍将rhBMP2溶解，再加入pH7.2，0.01M的PBS至6ml，将BSA加入上述抗原液中，搅拌状态下缓慢加入0.2％的戊二醛1.5ml，冰浴60分钟，再缓慢加入1.9ml 1M的甘氨酸冰浴60分钟，放入pH7.2，0.01M PBS透析过夜，得到rhBMP2-BSA复合物。(2)建立免疫方案并免疫动物：首先对实验家兔进行四次单一免疫，每次都是将rhBMP2-BSA与弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，注入兔的四足掌、背部皮下6点及大腿。从1到4次每只家兔获得rhBMP2依次为0.223mg----0.198mg。每次免疫持续时间21天。然后再对实验家兔进行两次分组对比免疫：第1组，将rhBMP2-BSA与弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂，注入1号家兔的颈部背部皮下共8点及大腿。家兔均获得rhBMP2为0.198mg。每次免疫持续时间21天。第2组，将rhBMP2-BSA与生理盐水混合制成水剂，注入2号家兔的颈部背部皮下共8点及大腿。家兔均获得rhBMP2为0.198mg。每次免疫持续时间7天。(3)抗血清效价的测定：自初次免疫后第9周起，每周测定抗血清效价，直至处死动物测最后的效价。方法则采用间接ELISA法。(4)rhBMP2抗体的制备：首先用免疫吸收法沉淀载体BSA抗体，每毫升血清加入BSA 5mg，混均后放4℃过夜。次日离心，可见有少量白色沉淀，弃去。将抗血清用50％的饱和硫酸盐析沉淀IgG，放4℃过夜，离心弃上清(rhBMP2抗体)，用pH7.2，0.01M的PBS溶解。再用33％的饱和硫酸盐析沉淀IgG，放4℃ 60分钟，离心弃上清，用pH7.2，0.01M的PBS溶解，重复3次。离心弃上清，对pH7.2，0.01M的PBS透析过夜。离心弃沉淀。