[发明专利]一种构建独特调节方式下特异性杀灭HIV感染细胞的新型重组HIV载体的方法

摘要

一种构建独特调节方式下特异性杀灭HIV感染细胞的新型重组HIV载体的方法：基因疗法是治疗艾滋病毒(HIV)感染和艾滋病的根本手段，而构建携带强大毒性蛋白编码基因的新型重组HIV载体(即仅表达1～几个毒性蛋白就足以杀死HIV感染细胞和HIV)，是最具吸引力和最有效的基因疗法之一，但构建新型重组HIV载体并非易事，其中最关键性难题是需要有非常可靠的调节方式来保障专一性杀灭HIV感染细胞和HIV而不损伤正常细胞。本发明利用人类的正常细胞基因组与HIV(主要指HIV－1型的野生型)基因组表达产物之间的差异性焦点，即HIV编码基因表达关键性产物所独有的作用机理，通过三种调节方式：①Rev蛋白调节方式。②蛋白酶调节方式。③Rev蛋白和蛋白酶双重调节方式。解决重组HIV载体的强大毒性蛋白编码基因仅在HIV感染细胞中表达，而不会有1分子毒性蛋白在正常细胞内出现的创新性方法，预期产品的独特作用最有可能根治艾滋病毒感染与艾滋病。

主权项

1、一种构建独特调节方式下特异性杀灭HIV感染细胞的新型重组HIV载体的方法，其特征在于利用HIV(主要指HIV-1型的野生型)基因组表达产物的3种特异性调节方式：①Rev蛋白调节方式。②蛋白酶调节方式。③Rev蛋白和蛋白酶双重调节方式。Rev蛋白特异性调节方式，指在构建新型重组HIV载体过程中，将CRS(顺式作用阻抑序列)与RRE(顺式作用抗阻抑序列)和(或)NRS(核阻留序列)等的DNA功能序列插入以供目的基因等外源性基因表达的重组HIV载体各自相应的合适位置，依赖与HIV的Rev蛋白特异的相互作用而发挥Rev蛋白重要的调节功能。在HIV感染细胞内，由于HIV基因组早期表达的Rev蛋白与RRE相互作用克服CRS的阻抑作用，同时Rev蛋白与NRS的相互作用，将未经剪切的病毒RNA运出细胞核。因此在Rev蛋白质所独有的作用下，HIV基因由早期(转录调节蛋白mRNA)向晚期(转录HIV结构蛋白mRNA)转化，其结果产生HIV结构蛋白组装病毒颗粒。在HIV感染细胞内，Rev蛋白同时也会与新型重组HIV载体中的RRE与CRS和(或)NRS相互作用，促进毒性蛋白编码基因顺利表达强大毒性蛋白杀灭HIV感染细胞和HIV。在正常细胞内，由于不存在HIV的Rev蛋白，因此新型重组HIV载体目的基因在CRS与RRE和(或)NRS独特的作用影响下，即使存在很低水平的毒性蛋白基因转录产物也将停留在细胞核内，最终被降解，而不会有毒性蛋白产生(注：本发明不涉及HIV的LTR与Tat蛋白和Tev蛋白之间的相互作用，因为这是本发明与其它重组病毒载体共用的调节方式)。蛋白酶特异性调节方式，指构建新型重组HIV载体过程中，在外源性目地基因的一侧或两侧连接上HIV蛋白酶特异性识别序列和酶切位点的编码基因片断，也可将gag或pol的某一特定产物编码基因或基因片段以合适位点与新型重组HIV载体的目地基因相连接(注：gag或pol本身含有蛋白酶识别序列和酶切位点)。在HIV感染细胞内，HIV基因组晚期表达的蛋白酶将pol蛋白切割成几个功能酶，也将Gag蛋白前体切割成多个蛋白质及多肽，最终装配成熟的病毒颗粒。在HIV感染细胞内，蛋白酶同时也会特异性将新型重组HIV载体编码基因表达的蛋白前体或某一特定聚蛋白切开，加工形成具有生物活性的强大毒性蛋白，介导杀灭HIV感染细胞和HIV。而在正常细胞内，新型重组HIV载体产生的毒性蛋白前体或某一特定聚蛋白，由于没有HIV蛋白酶的特异性结合和酶解作用，而只能是无生物学活性的无功能产物。Rev蛋白和蛋白酶双重调节方式，即从转录水平到翻译后加工水平对包括毒性蛋白编码基因在内的外源性基因产物，在成熟过程的不同阶段发挥特异性调节功能，其对HIV感染细胞和正常细胞作用机理如同前述或说明书。在构建新型重组HIV载体时，可将RRE、CRS、NRS以及蛋白酶特异性识别序列和酶切位点的相应基因片断，以合适位置插入或与外源性基因相连接而克隆其中。肯定会有多种不同的HIV载体构建方式，外源性目的基因表达效率也会因此不同，但都会产生一个共同结果。即在表达水平非常低的情况下，如仅1～几个毒性蛋白分子表达，也会杀死HIV感染细胞和HIV而不会损伤正常细胞。这就是本发明构建新型重组HIV载体与目前构建的携带自杀基因的各种重组病毒载体的不同之处。