[发明专利]生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法有效
| 申请号： | 02134404.3 | 申请日： | 2002-07-19 |
| 公开（公告）号： | CN1468862A | 公开（公告）日： | 2004-01-21 |
| 发明（设计）人： | 刘龙斌;杨琴;王敏荣;王军志 | 申请（专利权）人： | 广州铭康生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/435 | 分类号： | C07K14/435;C12N15/09;C12P21/02 |
| 代理公司： | 广州知友专利代理有限公司 | 代理人： | 邵毓琴 |
| 地址： | 510730广东省广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法，该方法采用全长基因合成的方法合成含上述突变位点的TNK－tPA基因，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO－DHFR－)中表达，经克隆和筛选获得高水平表达TNK－tPA的工程细胞株，利用细胞培养生物反应器持续培养工程细胞，收集细胞培养上清，经一系列柱层析分离纯化技术，获得rhTNK－tPA制品。本发明的目的基因在细胞中的表达水平高达18000IU/106cell/d，由此制备的rhTNK－tPA的单链比例高达80％以上，纯度高达95％以上；对于工业化规模而言，本发明所需的设备相对比较简单，成本低，工艺条件简单。 | ||
| 搜索关键词： | 生产 重组 组织 型纤溶酶原 激活剂 tnk 突变体 工艺 方法 | ||
【主权项】：
1.生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法，依次包括以下步骤：(1)定点突变天然t-PA获得含突变位点的TNK-tPA突变体基因；(2)构建表达载体pCdhfr；(3)以XhoI/XbaI双酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的1.7Kb的DNA片段，与以XhoI/XbaI双酶切的真核表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coli JM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，取阳性克隆株培养，得到重组表达质粒pCdhfr-mt-PA；(4)以TNK-tPA突变体表达质粒pCdhfr-mt-PA转染CHO(dhfr-)细胞，经克隆和筛选获得高水平表达TNK-tPA的工程细胞株；(5)利用细胞培养生物反应器持续培养工程细胞，收集细胞培养上清，经分离纯化获得rhTNK-tPA突变体。
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