[发明专利]一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法

摘要

本发明涉及一种从总核糖核酸(Total RNA)中有效分离全长、完整信使核糖核酸(mRNA)的方法。其特征在于用十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠作为核糖核酸酶(RNase)抑制剂，在溶解总RNA的溶液中和在分离mRNA用的溶液系统中均加入十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠以防止RNase对mRNA的降解，并通过两种缓冲液洗涤以除去mRNA以外的其它RNA和可能存在的RNase活性，从而有效地分离出全长、完整的mRNA分子。本发明方法成本低廉、mRNA得率高，特别适用于从内源性RNase活性高的哺乳动物细胞或组织中抽提的总RNA中分离纯化mRNA。

主权项

1、一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法，包括5个步骤：(1)溶解：把总核糖核酸干燥品溶解在含0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的无核糖核酸酶的水中，然后测定水中总核糖核酸浓度，并用变性琼脂糖凝胶电泳检测总核糖核酸的质量，当观察到18S核糖体核糖核酸带和28S核糖体核糖核酸带清晰，且两者亮度比为1∶2时，则可进行下一步骤；(2)变性：把上述检测合格的总核糖核酸水溶液放入60～70℃水浴中处理3～25分钟，以破坏核糖核酸的二级结构，使其多聚腺苷酸尾端裸露出来，立即置冰浴或冰盐浴中冷却至4～10℃；(3)吸附：在上述经过变性的总核糖核酸溶液中加入与之等体积的吸附缓冲液，然后吸附剂按1mg总核糖核酸3～150mg湿重的比例加入，用亲和色谱法吸附总核糖核酸中的信使核糖核酸；所述的吸附缓冲液组成为pH70～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.8～1.2mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠，所述的吸附剂是寡聚脱氧胸苷，即英文缩写为Oligo(dT)的物质，共价连接在载体上形成的物质或具有寡聚脱氧胸苷一样功能的、能与信使核糖核酸3′端的多聚腺苷酸通过氢键结合的物质连接在载体上形成的物质；(4)洗涤：上述吸附步骤完成后，分离去液相，固相的吸附剂先用平衡缓冲液洗涤，然后再用洗涤缓冲液洗涤，以除去吸附剂上信使核糖核酸以外的其他核糖核酸和可能存在的核糖核酸酶活性，洗涤后分离去液相；所述的平衡缓冲液的组成是：pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.4～0.6mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠；所述的洗涤缓冲液的组成是：pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.1～0.2mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠；(5)洗脱：用室温～70℃的洗脱缓冲液把吸附在吸附剂上的信使核糖核酸洗脱出来，然后收集含有信使核糖核酸的洗脱缓冲液；所述的洗脱缓冲液的组成是：pH7.0～8.0的5～20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0～5mmol/L乙二胺四乙酸和0～1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠。